WO2015193525A1 - Método para amplificar la detección de dianas en una matriz de cristal líquido alineado - Google Patents

Método para amplificar la detección de dianas en una matriz de cristal líquido alineado Download PDF

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WO2015193525A1
WO2015193525A1 PCT/ES2015/070459 ES2015070459W WO2015193525A1 WO 2015193525 A1 WO2015193525 A1 WO 2015193525A1 ES 2015070459 W ES2015070459 W ES 2015070459W WO 2015193525 A1 WO2015193525 A1 WO 2015193525A1
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liquid crystal
target
sample
flow
targets
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PCT/ES2015/070459
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Morten Andreas Geday
Eva OTÓN MARTÍNEZ
José Miguel Escolano Moyano
José Manuel OTÓN SÁNCHEZ
Patxi Xabier QUINTANA ARREGUI
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Universidad Politécnica de Madrid
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    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326Magnetic particles
    • G01N33/54333Modification of conditions of immunological binding reaction, e.g. use of more than one type of particle, use of chemical agents to improve binding, choice of incubation time or application of magnetic field during binding reaction
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    • G02FOPTICAL DEVICES OR ARRANGEMENTS FOR THE CONTROL OF LIGHT BY MODIFICATION OF THE OPTICAL PROPERTIES OF THE MEDIA OF THE ELEMENTS INVOLVED THEREIN; NON-LINEAR OPTICS; FREQUENCY-CHANGING OF LIGHT; OPTICAL LOGIC ELEMENTS; OPTICAL ANALOGUE/DIGITAL CONVERTERS
    • G02F1/00Devices or arrangements for the control of the intensity, colour, phase, polarisation or direction of light arriving from an independent light source, e.g. switching, gating or modulating; Non-linear optics
    • G02F1/01Devices or arrangements for the control of the intensity, colour, phase, polarisation or direction of light arriving from an independent light source, e.g. switching, gating or modulating; Non-linear optics for the control of the intensity, phase, polarisation or colour 
    • G02F1/13Devices or arrangements for the control of the intensity, colour, phase, polarisation or direction of light arriving from an independent light source, e.g. switching, gating or modulating; Non-linear optics for the control of the intensity, phase, polarisation or colour  based on liquid crystals, e.g. single liquid crystal display cells
    • G02F1/133Constructional arrangements; Operation of liquid crystal cells; Circuit arrangements
    • G02F1/1333Constructional arrangements; Manufacturing methods
    • G02F1/1337Surface-induced orientation of the liquid crystal molecules, e.g. by alignment layers
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/805Optical property

Definitions

  • the present invention falls within the field of the detection of microorganisms (bacteria, viruses and other microbes), microparticles, biomolecules or any type of target capable of being detected with a biorecognition molecule, in liquid crystal matrices.
  • microorganisms bacteria, viruses and other microbes
  • microparticles biomolecules or any type of target capable of being detected with a biorecognition molecule
  • biorecognition molecule in liquid crystal matrices.
  • thermotropic liquid crystal generally hydrophobic
  • aqueous sample including the target to be detected The binding of the target to the receptor modifies the surface, altering the alignment of the liquid crystal. This happens to be aligned perpendicularly to the interface to be aligned in parallel, thus signaling the presence of the target when placing cross polarizers.
  • This technology is related to the original publication: J.M. Brake, M.K. Daschner, Y.Y. Luk, and N.L. Abbott, "Biomolecular interactions at phospholipid- decorated surfaces of liquid crystals", Science vol. 302 (2094), 2003, and with the request of the same author US 2010/233729 A1. In some cases, a drop of liquid crystal deposited on a single substrate is used; in others, the liquid crystal is deposited in a plurality of wells that are exposed to the aqueous sample.
  • a device for the amplified detection of targets comprising: one or more joining means with the ability to form a complex with a target, liquid crystal, and light polarization means configured to visualize the alignment of said liquid crystal, characterized in that it comprises flow means with the ability to put said liquid crystal and said joining means in dynamic contact.
  • a second aspect is the method for detecting a target in a sample, characterized in that it comprises (i) contacting the sample with one or more joining means capable of binding to said target, (ii) operating flow means for create a flow of liquid crystal that contacts the joining means, (iii) visualize the alignment of the liquid crystal by means of polarized light, so that, if the target is present in the sample, one or more areas are observed misalignment in the liquid crystal.
  • the present invention introduces a method of signal amplification several hundred times the size of the target.
  • the invention represents a significant advance, because the instruments and even the area of application of liquid crystal biosensors are modified. A microscopy system is no longer necessary and large areas can be inspected, even with different receptors (aptamers, antibodies, proteins, ...) in the same device.
  • the method and device of the present invention makes use of the distortions caused in a liquid crystal matrix in flux by the presence of a body that modifies its alignment.
  • the sensor is based on the optical or electrical detection of this misalignment.
  • the detection and contact between the target / receptor complex and the liquid crystal did not imply any flow, and the detection was based on the distortion exerted on the resting liquid crystal.
  • the device and method of the present invention differs considerably from existing ones, and provides an amplification of the misalignment of the liquid crystal in the matrix far superior to that of the Devices known to date.
  • the detection method is based on the observation of a flow to detect interference in the linear flow of an aligned matrix.
  • Figure 1 shows a particular embodiment of a device of the invention in which the liquid crystal molecules (4) are aligned in the absence of the target and the sample appears completely dark (6).
  • the substrates A and B have an alignment layer (1), and a functionalization layer for specific targets (2). Between them are spacers (3) of micrometric calibrated size and, at both ends, crossed polarizers, one of them aligned in the direction of flow. Arrow (5) shows the flow direction of the liquid crystal.
  • Figure 2 shows the same device of Figure 1, but in which the presence of a target (7) produces a disturbed flow (8), misaligning the molecules of the liquid crystal and producing a signal (10), when observed between cross polarizers.
  • Figure 3 is analogous to Figure 1, but in this case the original alignment of the liquid crystal is homeotropic (perpendicular).
  • Figure 4 is analogous to Figure 2, but in this case the original alignment of the liquid crystal is homeotropic (perpendicular).
  • FIGS 5, 6 and 7 are photographs of some results obtained with devices and methods according to the present invention.
  • a flow of the Sunset Yellow liotropic liquid crystal is applied and the results between cross polarizers are observed.
  • the targets that have been detected have a size between 2 to 12 micrometers in diameter. There is a very marked misalignment and a disturbed flow behind these particles.
  • the device of the present invention comprises: one or more joining means with the ability to form a complex with a target, liquid crystal, light polarization means configured to visualize the alignment of the liquid crystal and means of flow with the ability to put said liquid crystal in dynamic contact with said joining means.
  • the types of samples that can be analyzed are, in general, any that admits the fixation of the target in the binding means.
  • body fluids of humans and animals including milk and derivatives, water courses, irrigation, sewage and sewage, wells and reservoirs, river and maritime waters for detection of pathogenic microbes or microalgae
  • the device can thus be used at different points in the food chain, manufacturing controls of raw materials of biological origin or destination.
  • target is understood as any substance capable of specifically binding to the binding means (receptors) and thus causing misalignment in the flow of liquid crystal.
  • the target is selected from the group consisting of microparticles, organic molecules or biomolecules, for example, proteins, DNA, RNA or fragments thereof.
  • the target is selected from the group consisting of microorganisms or fragments thereof.
  • microorganisms although not limited only to them, there may be mentioned: bacteria, viruses, yeasts, eukaryotic cells and other microbes.
  • Liquid crystals are materials that are in an intermediate state between solid and liquid. They are ordered like solids, but they can flow like liquids. Many substances reach the liquid crystal state in certain temperature or concentration ranges.
  • the first are called thermotropic liquid crystals and the second liotropic liquid crystals. In the present invention both types can be used.
  • Thermotropic liquid crystals for example 5CB (4-cyano-4'-pentylbiphenyl), MBBA (N- (4-methoxybenzylidene) -4-butylaniline), commercial mixtures of liquid crystals can be used Merck thermotropics such as MDA-98, MLC-6023-000, MLC-6042-000, MLC-6204-100, MLC-6019-100, MLC-13000-000, MLC-6401, MLC-6290-000, MLC- 6025-000, MDA-01 -130, MLC-6096, MDA-02-3900, MDA-02-4476, MLC-6025, ZLI-3417-000, ZLI-3417-100, ZLI- 2788-000, ZLI- 3700-000, ZLI-1565-H, ZLI-3449-000, ZLI-3449-100, ZLI-21 16-100, ZLI-3261, ZLI-1957/5, ZLI-3786 and ZLI-81 1.
  • Lyotropic liquid crystals such as the commercial dye Sunset Yellow FCF ((5E) -6-oxo-5 - [(4-sulfonatophenyl) hydrazinyliden] naphthalen-2-sulphonate disodium) or Cromolyn (5- [3- (2) acid may also be used.
  • -carboxy-4- oxochromen-5-yl) oxy-2-hydroxypropoxy] -4-oxochromen-2-carboxylic acid and also other chromonic liotropics or mixtures of all of the above.
  • the device of the present invention can adopt various configurations, as long as it is possible that the flow of liquid crystal and the joining means dynamically come into contact.
  • the device is a cell comprising a first substrate with a first outer face and a first inner face, and a second substrate with a second outer face and a second inner face, wherein at least one of the substrates is totally or partially transparent.
  • the polarization means preferably crossed polarizers, are placed on the outer faces. Between both inner faces, facing each other, spacers are placed and at least one of them deposits a functionalization layer.
  • Each of the substrates can be composed, for example, of glass, silicon, quartz or polymeric materials.
  • FIG. 1 A particular embodiment of the device of the invention is exemplified in Figures 1 and 2, with homogeneous alignment of the liquid crystal, and in Figures 3 and 4, with homeotropic alignment.
  • At least one of the inner faces includes an alignment layer.
  • Said alignment layer is preferably adequately conditioned using organic or inorganic compounds or other methods to induce alignment by physical procedures.
  • organic or inorganic compounds or other methods to induce alignment by physical procedures.
  • conditioning with or without surface rubbing, photoalignment, stabilization in 2D or 3D, or any other type of procedure used as standard, with or without the application of external electric or magnetic fields.
  • the person skilled in the art can use any of the methods described in the literature see for example: IH Bechtold, ML Vega, EA Oliveira, JJ Bonvent "Surface Treatments for Lyotropic Liquid Crystals Alignment", Molecular Crystals and Liquid Crystals, vol. 391 (1), 2003; U. Kaeder and K.
  • binding elements are fixed on at least one of the two inner faces, forming a functionalization layer, which preferably includes specific target receptors based on antibodies, aptamers, DNA, RNA, proteins, functional fragments of the same or any other type of molecule with recognition function.
  • the binding to the inner face of these joining means can be performed by covalent bonding, ionic bonding, van der Waals interactions, chemisorption, fisisorption or combinations thereof.
  • two or more joining means can be used with the ability to complex with one or more different specific targets. It is particularly useful that each of said two or more joining elements are fixed in different regions of the substrate.
  • the device is configured so that it lacks joining means in one of its regions, which acts as a negative control.
  • the cell is assembled once the substrate surfaces are prepared.
  • spacers are used, preferably microspheres of calibrated size, whose function is to ensure a homogeneous thickness over the entire surface of the cell.
  • an adhesive for example, a UV curing one
  • the spacers are preferably placed outside the active area of the device to avoid false positives.
  • the first substrate and the second substrate are separated by a distance between 1 and 1000 ⁇ , preferably between 5 and 600 ⁇ , more preferably between 10 and 500 ⁇ .
  • the cell is filled with the problem liquid sample in which it is desired to evaluate the presence of the target.
  • the sample can be pretreated with microparticles capable of binding to the target.
  • the cell is washed with a suitable buffer solution.
  • the solution in which it is desired to evaluate the presence of the target and the liquid crystal is mixed before being introduced into the cell, so that the liquid crystal and the target (if present) come into dynamic contact with the means of union.
  • the flow of liquid crystal is activated, which can be done by positive or negative pressure, centrifugal force or capillarity, depending on the structure of the cell and its thickness. It can also be done with a simple fluidic system.
  • the flow of liquid crystal in the cell begins, which flows with a preferential direction within the device.
  • the liquid crystal is unaffected and there is no misalignment, as observed by placing the device between crossed polarizers.
  • a disturbed flow occurs behind that target (“downstream").
  • downstream When the cell is observed between crossed polarizers a significant misalignment is detected while the liquid crystal flows. This misalignment is sufficient to observe the presence of targets with the naked eye or with a lens.
  • the device of the present invention is preferably marketed ready to introduce the sample and is small in size, allowing the analysis of samples "in situ".
  • the device may include viewing and recording media, such as cameras or videos.
  • the amplification is sufficient to be observed with the naked eye or with a small lens, for example, between 2 and 20 magnifications.
  • the misalignment in the liquid crystal is observed by one or more of the methods that are selected from the group consisting of a colorimetric method, by a change in conductivity and / or by a change in permeability.
  • the manufacture of the device of the present invention can be carried out according to methods described in the literature, related or not related to sensors, such as in: S. Kumar, J. Noh and CH Jang, "State of the Art in Liquid Crystals Nanophysiochemical Properties at Surfaces and Interfaces and Frontier for Posterity ", Biochip Journal, vol. 3 (3), 181-189, 2009; and A. Hussain, AS Pina and ACA Roque, "Bio-recognition and detection using liquid crystals", Biosensors and Bioelectronics, vol. 25 (1), 2009. Detection Method
  • the method of the present invention comprises contacting a sample in which it is desired to detect the presence of a target and a device where the target is to be specifically attached.
  • the target is attached to connecting elements.
  • the presence of the target attached to the binding elements causes a disturbance in the alignment of the liquid crystal molecules.
  • the liquid crystal When the liquid crystal is introduced there is a flow of ordered molecules in one direction. When the liquid crystal encounters a target, a disturbed flow "downstream" is created with respect to it. This disturbance produces a misalignment effect that, as the inventors have discovered, is extraordinarily pronounced, and can be seen as a fine line, significantly greater than any amplification effect described in the literature. The effect can be observed while the liquid crystal flows through the cell, but also shortly after the end of the flow (tens of seconds or minutes, depending on the liquid crystal, thickness, temperature and some other factors). The amplification factor depends on the flow rate; typically, amplification factors of several hundred are achieved. The effect allows even the detection of targets with the naked eye. When the flow stops, the liquid crystal molecules begin to realign. According to an embodiment of the invention, the detection is performed at the time of introducing the liquid crystal or immediately after. In another embodiment, the detection takes place up to 20 minutes later or 1 to 5 minutes later, always before realignment of the liquid crystal molecules occurs.
  • the amplification method may include specific binding of secondary groups (for example, aptamers, antibodies, affibodys, peptides, molecules with affinity for any target component, etc.) that specifically adhere to the targets.
  • Secondary groups may include: microparticles (for example, paramagnetic particles, carbon nanotubes, sepharose microparticles, gold nanoparticles, etc.) or catalysts, especially enzymatic (for example, catalase or peroxidases).
  • Secondary groups that include microparticles would cause or amplify the misalignment that occurs around the target after the group joins secondary. Such misalignment or amplification thereof can be caused by: the volume of the particle, the magnetic or electrical properties of the particle, the agglutination capacity of the particles, etc.
  • microparticles such as gold nanoparticles, could influence the particles. optical properties of the nearby liquid crystal.
  • Secondary groups that include catalysts can act in different ways. On the one hand, they can degrade specific compounds within the medium in which the liquid crystal is found, producing secondary compounds that give rise to the amplification signal. This could be the case, for example, of a catalase linked to a secondary group that would degrade H 2 0 2 that could be present in the medium producing oxygen bubbles in the environment of the bound target.
  • the catalysts can have a degradation activity of the liquid crystal molecules, causing misalignment in that area, which would result in the passage of light in the affected area in a dark cell or, conversely, a dark area in a cell that allows the passage of light.
  • chloroperoxidase that has been described as an enzyme capable of degrading Sunset Yellow: J. Zhang, M. Feng, Y. Jiang, M. Hu, S. Li, Q. Zhai, "Efficient decolorization / degradation of aqueous azo dyes using buffered H 2 0 2 oxidation catalyzed by a dosage below ppm level of chloroperoxidase ", Chemical Engineering Journal, vol. 191, 236-242, 2012.
  • Two flat substrates are selected. One of them, at least, must be transparent.
  • the material from which the substrates are made can be glass, quartz, or transparent polymers such as e.g. ex. PMMA If the second substrate is also not transparent, it can be made of metal, ceramic, silicon or other inert and rigid materials. Both substrates must be suitable (and conditioned) for the deposition of layers described below.
  • the alignment layer is deposited on the inner face of at least one of the two substrates.
  • the alignment layer may include organic or inorganic compounds, or methods for inducing alignment by physical procedures: the layer may be conditioned with or without surface rubbing, or by photoalignment, 2D or 3D stabilization or any other type of procedure used as standard with or without the application of external electric or magnetic fields.
  • At least one of the two substrates specific target receptors are fixed based on: antibodies, aptamers, DNA, RNA, proteins or functional fragments thereof, etc.
  • the substrate can be fully functionalized or only in a specific area.
  • the functionalization consists in modifying the surface of the substrate by introducing chemical functional groups that will bind to specific targets.
  • the two substrates are assembled, forming a cell with the inner faces facing each other and with a calibrated distance (from one micrometer to several hundred micrometers) between both substrates.
  • the test sample which contains the target to be detected in the cell, is introduced.
  • the cells can be filled by positive or negative pressure, centrifugal force or capillarity, depending on the structure of the cell and its thickness.
  • the inside of the cell is washed with a suitable buffer solution, using one of the filling methods in section 5.
  • the liquid crystal is introduced into the cell using any of the flow elements described above.
  • the cell is placed between crossed polarizers for target detection.
  • the polarizers can also be placed by attaching them to the external faces of the substrates prior to cell assembly.

Abstract

La presente invención se refiere a un método para amplificar la detección de dianas en una matriz de cristal líquido alineado y a un dispositivo para la detección amplificada de dianas que comprende: uno o más elementos de unión con la capacidad de formar un complejo con una diana, cristal líquido, y medios de polarización configurados para visualizar el alineamiento del cristal líquido. El dispositivo está caracterizado porque comprende medios de flujo con la capacidad de poner en contacto dinámico dicho cristal líquido con los mencionados elementos de unión. Los métodos de detección amplificada están basados en el contacto dinámico entre un flujo de cristal líquido y elementos de unión con capacidad de formar complejos con la diana.

Description

MÉTODO PARA AMPLIFICAR LA DETECCIÓN DE DIANAS EN UNA MATRIZ DE CRISTAL LÍQUIDO ALINEADO
DESCRIPCIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se encuadra en el campo de la detección de microorganismos (bacterias, virus y otros microbios), micropartículas, biomoléculas o cualquier tipo de diana susceptible de ser detectada con una molécula de biorreconocimiento, en matrices de cristal líquido. Mediante el uso de un nuevo mecanismo de amplificación, se consigue un aumento significativo en la sensibilidad de detectores basados en cristales líquidos.
ESTADO DE LA TÉCNICA
La primera mención del uso de dispositivos basados en cristal líquido como sensores aparece en el artículo: V.K. Gupta, J.J. Skaife, T.B. Dubrovsky, N.L. Abbott, "Optical amplification of ligand-receptor binding using liquid crystals", Science vol. 279 (5359), 1998, y la solicitud de patente US 2002/0142453 A, en los cuales se muestra el desalineamiento que se produce en una célula de cristal líquido por el cambio de rugosidad de sus superficies de alineamiento. Se describen las distorsiones causadas en el cristal líquido por dianas que se han unido específicamente a un receptor. Las zonas en las que no hay diana aparecen oscuras, mientras que en las zonas en donde se han unido dianas se produce desalineamiento del cristal líquido, causando la aparición de puntos brillantes en el fondo oscuro. El tamaño de dichos puntos es mayor que las propias dianas. Desde entonces, se han buscado materiales y metodologías que mejoren estos sistemas, dotándolos de una mayor sensibilidad y fiabilidad.
Así, en la solicitud de patente WO 2007/036905 A2 (C. Woolverton, 2007) se describe un sensor de cristal líquido, en el que se emplean micropartículas superparamagnéticas suspendidas dentro del mismo. La unión de partículas diana a estas micropartículas produce un cambio en el alineamiento del cristal líquido, causando la aparición de puntos brillantes en un fondo oscuro cuando se observan las células entre polarizadores cruzados con la ayuda de un microscopio. En la patente US 6,41 1 ,354 B1 (O.D. Lavrentovich, T. Ishikawa, 2002), se detallan formas para alinear un tipo específico de cristales líquidos (cristales líquidos liotrópicos cromónicos), para la fabricación de células de cristal líquido con aplicaciones, por ejemplo, a biosensores.
También se conoce la detección de dianas específicas en la interfase entre un cristal líquido termotrópico, generalmente hidrófobo, y una muestra acuosa que incluye la diana que se pretende detectar. La unión de la diana al receptor modifica la superficie, alterando el alineamiento del cristal líquido. Éste pasa de estar alineado perpendicularmente a la interfase a estar alineado en paralelo, señalando así la presencia de la diana al colocar polarizadores cruzados. Esta tecnología está relacionada con la publicación original: J.M. Brake, M.K. Daschner, Y.Y. Luk, y N.L. Abbott, "Biomolecular interactions at phospholipid- decorated surfaces of liquid crystals", Science vol. 302 (2094), 2003, y con la solicitud del mismo autor US 2010/233729 A1 . En algunos casos, se emplea una gota de cristal líquido depositada sobre un único sustrato; en otros, el cristal líquido se deposita en una pluralidad de pozos que se exponen a la muestra acuosa.
Estas técnicas de detección prometen avances importantes, aunque todavía requieren mejoras, por ejemplo, en su sensibilidad, fiabilidad o simplicidad de uso. El mayor problema de los métodos mencionados es que el factor de amplificación que se obtiene es raramente superior a unas decenas de veces del tamaño de la diana. Esto implica que la detección de micropartículas requiere el uso de un microscopio o un sistema de lentes. El uso de aparatos de microscopía no solo incrementa el coste del sistema de detección, además reduce el área de inspección a pocos milímetros cuadrados. Reducir el área de inspección puede reducir significativamente la sensibilidad del sistema, ya que se encontrará un número menor de dianas ligadas al sustrato. El uso de un microscopio, además, suele incluir un sistema microfluídico que es incompatible con muestras muy viscosas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Los inventores han diseñado un dispositivo y procedimiento mejorado para la detección de dianas, basados en cristales líquidos. A diferencia de otros, este procedimiento es más sensible, no requiere instrumentación adicional, y en consecuencia resulta de manejo más sencillo. Es por tanto un primer aspecto de la presente invención un dispositivo para la detección amplificada de dianas que comprende: uno o más medios de unión con la capacidad de formar un complejo con una diana, cristal líquido, y medios de polarización de luz configurados para visualizar el alineamiento de dicho cristal líquido, caracterizado porque comprende medios de flujo con la capacidad de poner en contacto dinámico dicho cristal líquido y dichos medios de unión.
Un segundo aspecto es el método para la detección de una diana en una muestra, caracterizado porque comprende (i) poner en contacto la muestra con uno o más medios de unión con capacidad de unirse a dicha diana, (ii) accionar medios de flujo para crear un flujo de cristal líquido que contacte con los medios de unión, (iii) visualizar el alineamiento del cristal líquido mediante medios de luz polarizada, de forma que, en caso de estar la diana presente en la muestra, se observe una o más áreas de desalineamiento en el cristal líquido.
La presente invención introduce un método de amplificación de la señal de varios centenares de veces el tamaño de la diana. La invención supone un significativo avance, porque se modifica el instrumental e incluso el área de aplicación de los biosensores de cristal líquido. Ya no resulta necesario un sistema de microscopía y se pueden inspeccionar grandes áreas, incluso con distintos receptores (aptámeros, anticuerpos, proteínas,..) en el mismo dispositivo.
El método y dispositivo de la presente invención hace uso de las distorsiones provocadas en una matriz de cristal líquido en flujo por la presencia de un cuerpo que modifica su alineamiento. El sensor se basa en la detección óptica o eléctrica de este desalineamiento.
En los sensores conocidos hasta el momento, la detección y el contacto entre el complejo diana/receptor y el cristal líquido no implicaba ningún flujo, y la detección se basaba en la distorsión ejercida sobre el cristal líquido en reposo. Al realizar la detección mientras el cristal líquido está en contacto dinámico con la muestra, se produce una amplificación significativamente mayor que en otros métodos. En consecuencia, el dispositivo y método de la presente invención difiere considerablemente de otros ya existentes, y proporciona una amplificación del desalineamiento del cristal líquido en la matriz muy superior a la de los dispositivos conocidos hasta la fecha. El método de detección se basa en la observación de un flujo para detectar interferencias en el flujo lineal de una matriz alineada.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La figura 1 muestra una realización particular de un dispositivo de la invención en el que las moléculas de cristal líquido (4) se encuentran alineadas en ausencia de la diana y la muestra aparece completamente oscura (6). Los sustratos A y B presentan una capa de alineamiento (1 ), y una capa de funcionalización para dianas específicas (2). Entre ambas se sitúan espaciadores (3) de tamaño calibrado micrométrico y, en ambos extremos, unos polarizadores cruzados, uno de ellos alineado en la dirección de flujo. La flecha (5) muestra la dirección de flujo del cristal líquido.
La figura 2 muestra el mismo dispositivo de la figura 1 , pero en el que la presencia de una diana (7) produce un flujo perturbado (8), desalineando las moléculas del cristal líquido y produciendo una señal (10), al ser observado entre polarizadores cruzados.
La figura 3 es análoga a la figura 1 , pero en este caso el alineamiento original del cristal líquido es homeotrópico (perpendicular).
La figura 4 es análoga a la figura 2, pero en este caso el alineamiento original del cristal líquido es homeotrópico (perpendicular).
Las figuras 5, 6 y 7 son fotografías de algunos resultados obtenidos con dispositivos y métodos de acuerdo con la presente invención. En todos los casos, se aplica un flujo del cristal líquido liotropico Sunset Yellow y se observan los resultados entre polarizadores cruzados. Las dianas que se han detectado tienen un tamaño entre 2 a 12 micrómetros de diámetro. Se observa un desalineamiento muy acentuado y un flujo perturbado detrás de dichas partículas. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Dispositivo
En su forma más sencilla, el dispositivo de la presente invención comprende: uno o más medios de unión con la capacidad de formar un complejo con una diana, cristal líquido, medios de polarización de la luz configurados para visualizar el alineamiento del cristal líquido y medios de flujo con la capacidad de poner en contacto dinámico dicho cristal líquido con dichos medios de unión.
Los tipos de muestras que se pueden analizar son, en general, cualquiera que admita la fijación de la diana en los medios de unión. Como ejemplos, aunque no limitados solo a ellos, se pueden citar: fluidos corporales de humanos y animales incluyendo leche y derivados, cursos de agua, regadíos, desagües y aguas residuales, pozos y aljibes, aguas fluviales y marítimas para detección de microbios patógenos o microalgas. Se puede así utilizar el dispositivo en distintos puntos de la cadena de alimentación, controles de fabricación de materias primas de origen o destino biológico.
En la presente invención, se entiende por diana cualquier sustancia capaz de unirse específicamente a los medios de unión (receptores) y así provocar desalineamiento en el flujo de cristal líquido. En una realización particular, la diana se selecciona del grupo que consiste en micropartículas, moléculas orgánicas o biomoléculas, por ejemplo, proteínas, ADN, ARN o fragmentos de los mismos. En otra realización, la diana se selecciona del grupo que consiste en microorganismos o fragmentos de los mismos. Como ejemplos de microorganismos, aunque no limitados solo a ellos, se pueden citar: bacterias, virus, levaduras, células eucariotas y otros microbios.
Los cristales líquidos son materiales que están en un estado intermedio entre sólido y líquido. Están ordenados como los sólidos, pero pueden fluir como los líquidos. Muchas sustancias alcanzan el estado cristal líquido en determinados rangos de temperatura o de concentración. Los primeros se denominan cristales líquidos termotrópicos y los segundos cristales líquidos liotrópicos. En la presente invención se pueden emplear ambos tipos.
Pueden usarse cristales líquidos termotrópicos, por ejemplo 5CB (4-ciano-4'-pentilbifenilo), MBBA (N-(4-metoxibenciliden)-4-butilanilina), mezclas comerciales de cristales líquidos termotrópicos de Merck como MDA-98, MLC-6023-000, MLC-6042-000, MLC-6204-100, MLC-6019-100, MLC-13000-000, MLC-6401 , MLC-6290-000, MLC-6025-000, MDA-01 -130, MLC-6096, MDA-02-3900, MDA-02-4476, MLC-6025, ZLI-3417-000, ZLI-3417-100, ZLI- 2788-000, ZLI-3700-000, ZLI-1565-H, ZLI-3449-000, ZLI-3449-100, ZLI-21 16-100, ZLI-3261 , ZLI-1957/5, ZLI-3786 y ZLI-81 1 . También pueden emplearse cristales líquidos liotrópicos como el colorante comercial Sunset Yellow FCF ((5E)-6-oxo-5-[(4-sulfonatofenil) hidraciniliden] naftalen-2-sulfonato disódico) o Cromolyn (ácido 5-[3-(2-carboxi-4- oxocromen-5-il)oxi-2-hidroxipropoxi]-4-oxocromen-2-carboxílico), y también otros liotrópicos cromónicos o mezclas de todos los anteriores.
El dispositivo de la presente invención puede adoptar diversas configuraciones, siempre y cuando sea posible que entren en contacto de forma dinámica el flujo de cristal líquido y los medios de unión. En una realización preferida, el dispositivo es una célula que comprende un primer sustrato con una primera cara exterior y una primera cara interior, y un segundo sustrato con una segunda cara exterior y una segunda cara interior, en donde al menos uno de los sustratos es total o parcialmente transparente. De acuerdo con esta realización particular, sobre las caras exteriores se colocan los medios de polarización, preferiblemente polarizadores cruzados. Entre ambas caras interiores, enfrentadas entre sí, se sitúan espaciadores y al menos en una de ellas se deposita una capa de funcionalización. Cada uno de los sustratos puede estar compuesto, por ejemplo, por vidrio, silicio, cuarzo o materiales poliméricos.
Una realización particular del dispositivo de la invención se ejemplifica en las figuras 1 y 2, con alineamiento homogéneo del cristal líquido, y en las figuras 3 y 4, con alineamiento homeotrópico.
Al menos una de las caras interiores incluye una capa de alineamiento. Dicha capa de alineamiento preferiblemente se acondiciona adecuadamente utilizando compuestos orgánicos o inorgánicos u otros métodos para inducir alineamiento por procedimientos físicos. Como ejemplos, aunque no limitados solo a ellos, se pueden citar: el acondicionamiento con o sin frotado de la superficie, el fotoalineamiento, la estabilización en 2D o 3D, o cualquier otro tipo de procedimiento utilizado de forma estándar, con o sin la aplicación de campos eléctricos o magnéticos externos. En cada caso, el experto en la materia puede utilizar cualquiera de los métodos descritos en la literatura véase por ejemplo: I. H. Bechtold, M. L. Vega, E. A. Oliveira, J. J. Bonvent "Surface Treatments for Lyotropic Liquid Crystals Alignment", Molecular Crystals and Liquid Crystals, vol. 391 (1 ), 2003; U. Kaeder y K. Hiltrop. "Alignment of lyotropic nematics by surface action", Trends in Colloid and Interface Science, vol. 84, 250-252, 1991 ; L. Parry Jones, "Alignment Properties of Liquid Crystals", Handbook of Visual Display Technology, 1387-1402, 2012, así como la patente mencionada más arriba US 6,41 1 ,354 B1 . Preferiblemente, en al menos una de las dos caras interiores se fijan elementos de unión, formando una capa de funcionalizacion, la cual incluye, preferiblemente, receptores específicos de la diana basados en anticuerpos, aptámeros, DNA, RNA, proteínas,fragmentos funcionales de los mismos o cualquier otro tipo de molécula con función de reconocimiento. La unión a la cara interior de estos medios de unión se puede realizar por enlace covalente, enlace iónico, interacciones de van der Waals, quimisorción, fisisorción o combinaciones de los mismos. Con el objeto de detectar una pluralidad de dianas en un mismo dispositivo, se pueden usar dos o más medios de unión con la capacidad de formar complejos con una o más dianas específicas distintas. Resulta particularmente útil que cada uno de dichos dos o más elementos de unión, se encuentren fijos en regiones distintas del sustrato. Preferiblemente, el dispositivo se configura de forma que carece de medios de unión en una de sus regiones, la cual actúa como control negativo.
De acuerdo con esta realización particular, la célula se monta una vez preparadas las superficies de los sustratos. En el montaje se utilizan espaciadores, preferiblemente microesferas de tamaño calibrado, cuya función es asegurar un espesor homogéneo en toda la superficie de la célula. Para sellar la célula y mantener los sustratos unidos se utiliza, preferiblemente, un adhesivo (por ejemplo, uno de curado UV). Los espaciadores se colocan, preferiblemente, fuera del área activa del dispositivo para evitar falsos positivos. De acuerdo con una realización particular, el primer sustrato y el segundo sustrato están separados por una distancia de entre 1 y 1000 μηι, preferiblemente entre 5 y 600 μηι, más preferiblemente entre 10 y 500 μηι.
En una realización particular, la célula se llena con la muestra líquida problema en la que se quiere evaluar la presencia de la diana. La muestra se puede tratar previamente con micropartículas capaces de unirse a la diana. Después, se lava la célula con una solución tampón adecuada. En otra realización particular, la disolución en la que se quiere evaluar la presencia de la diana y el cristal líquido se mezclan antes de ser introducidos en la célula, de forma que el cristal líquido y la diana (si está presente) entran en contacto dinámico con los medios de unión.
Después, se activa el flujo de cristal líquido, lo cual puede hacerse por presión positiva o negativa, fuerza centrífuga o capilaridad, dependiendo de la estructura de la célula y su espesor. También puede hacerse con un sistema fluídico simple. Se inicia, así, el flujo de cristal líquido en la célula, el cual fluye con una dirección preferencial dentro del dispositivo. Cuando en la cara interior de los sustratos no se ha unido ninguna diana, el cristal líquido no se ve afectado y no hay desalineamientos, según se observa colocando el dispositivo entre polarizadores cruzados. Cuando el cristal líquido se encuentra con una diana que esté unida a la superficie, se produce un flujo perturbado detrás de dicha diana ("corriente abajo"). Cuando se observa la célula entre polarizadores cruzados se detecta un desalineamiento significativo mientras fluye el cristal líquido. Este desalineamiento es suficiente para observar la presencia de dianas a simple vista o con una lente.
El dispositivo de la presente invención se comercializa, preferiblemente, preparado para introducir la muestra y es de pequeño tamaño, permitiendo realizar el análisis de muestras "in situ". El dispositivo puede incluir medios de visualización y grabado, tales como cámaras o vídeos. De acuerdo con una realización particular, la amplificación es suficiente como para observarse a simple vista o con una pequeña lente, por ejemplo, de entre 2 y 20 aumentos. De acuerdo con una realización alternativa, el desalineamiento en el cristal líquido se observa mediante uno o más de los métodos que se seleccionan del grupo que consiste en un método colorimétrico, mediante un cambio de conductividad y/o mediante un cambio de permeabilidad.
La fabricación del dispositivo de la presente invención puede realizarse siguiendo métodos descritos en la bibliografía, relacionados o no con sensores, como por ejemplo en: S. Kumar, J. Noh y C.H. Jang, "State of the Art in Liquid Crystals Nanophysiochemical Properties at Surfaces and Interfaces and Frontier for Posterity", Biochip Journal, vol. 3 (3), 181 -189, 2009; y A. Hussain, A.S Pina y A.C.A. Roque, "Bio-recognition and detection using liquid crystals", Biosensors and Bioelectronics, vol. 25 (1 ), 2009. Método de Detección
El método de la presente invención comprende poner en contacto una muestra en la que se quiere detectar la presencia de una diana y un dispositivo en donde se va a unir la diana de forma específica. La diana se une a unos elementos de unión.
Cuando se llena el dispositivo con cristal líquido en una célula previamente preparada para alinearlo en una dirección específica, la presencia de la diana unida a los elementos de unión provoca una perturbación en el alineamiento de las moléculas de cristal líquido.
Cuando se introduce el cristal líquido se produce un flujo de moléculas ordenadas en una dirección. Cuando el cristal líquido encuentra una diana se crea un flujo perturbado "corriente abajo" respecto a la misma. Esta perturbación produce un efecto de desalineamiento que, según han descubierto los inventores, es extraordinariamente acusado, y que puede observarse como una línea fina, significativamente mayor que cualquier efecto de amplificación descrito en la bibliografía. El efecto se puede observar mientras el cristal líquido fluye a través de la célula, aunque también poco después de finalizado el flujo (decenas de segundos o minutos, dependiendo del cristal líquido, el espesor, la temperatura y algunos otros factores). El factor de amplificación depende de la velocidad de flujo; típicamente, se alcanzan factores de amplificación de varios cientos. El efecto permite incluso la detección de dianas a simple vista. Cuando se detiene el flujo, las moléculas de cristal líquido empiezan a realinearse. De acuerdo con una realización de la invención, la detección se realiza en el momento de introducir el cristal líquido o inmediatamente después. En otra realización, la detección tiene lugar hasta 20 minutos después o entre 1 y 5 minutos después, siempre antes de que se produzca el realineamiento de las moléculas de cristal líquido.
El método de amplificación puede incluir uniones específicas de grupos secundarios (por ejemplo, aptámeros, anticuerpos, affibodys, péptidos, moléculas con afinidad por cualquier componente de la diana, etc ..) que se adhieren a las dianas de forma específica. Los grupos secundarios pueden incluir: micropartículas (por ejemplo, partículas paramagnéticas, nanotubos de carbono, micropartículas de sefarosa, nanopartículas de oro, etc ..) o catalizadores, especialmente enzimáticos (por ejemplo, catalasas o peroxidasas). Los grupos secundarios que incluyen micropartículas provocarían o amplificarían el desalineamiento que se produce en torno a la diana después de que se una el grupo secundario. Dicho desalineamiento o amplificación del mismo puede ser provocado por: el volumen de la partícula, las propiedades magnéticas o eléctricas de la partícula, la capacidad de aglutinación de las partículas, etc .. Otras micropartículas, como las nanopartículas de oro, podrían influir en las propiedades ópticas del cristal líquido que se encuentra próximo. Los grupos secundarios que incluyen catalizadores pueden actuar de distintas formas. Por un lado, pueden degradar compuestos específicos dentro del medio en que se encuentra el cristal líquido, produciendo compuestos secundarios que den lugar a la señal de amplificación. Este podría ser el caso, por ejemplo, de una catalasa unida a un grupo secundario que degradaría el H202 que podría estar presente en el medio produciendo burbujas de oxígeno en el entorno de la diana enlazada. Por otro lado, los catalizadores pueden tener una actividad de degradación de las moléculas de cristal líquido, provocando el desalineamiento en esa zona, que se traduciría en el paso de la luz en la zona afectada en una célula oscura o, a la inversa, una zona oscura en una celda que permite el paso de la luz. Un ejemplo podría ser la cloroperoxidasa que se ha descrito como una enzima capaz de degradar Sunset Yellow: J. Zhang, M. Feng, Y. Jiang, M. Hu, S. Li, Q. Zhai, "Efficient decolorization/degradation of aqueous azo dyes using buffered H202 oxidation catalyzed by a dosage below ppm level of chloroperoxidase", Chemical Engineering Journal, vol. 191 , 236-242, 2012.
A continuación, se ofrecen a modo ilustrativo algunas realizaciones preferidas de la invención, la cual no debe considerarse limitada solo a ellos.
REALIZACIONES PREFERIDAS
1 . Se seleccionan dos sustratos planos. Uno de ellos, al menos, debe ser transparente. El material del que están hechos los sustratos puede ser vidrio, cuarzo, o polímeros transparentes como p. ej. PMMA. Si el segundo sustrato no es también transparente puede ser de metal, cerámica, silicio u otros materiales inertes y rígidos. Ambos sustratos deben ser adecuados (y acondicionados) para la deposición de capas que se describe a continuación.
2. Se deposita una capa de alineamiento en la cara interior de, al menos, uno de los dos sustratos. La capa de alineamiento puede incluir compuestos orgánicos o inorgánicos, o métodos para inducir alineamiento por procedimientos físicos: la capa puede acondicionarse con o sin frotado de la superficie, o por fotoalineamiento, estabilización en 2D o 3D o cualquier otro tipo de procedimiento utilizado de forma estándar con o sin la aplicación de campos eléctricos o magnéticos externos.
3. En al menos uno de los dos sustratos se fijan receptores de dianas específicas basados en: anticuerpos, aptámeros, DNA, RNA, proteínas o fragmentos funcionales de los mismos, etc. El sustrato se puede funcionalizar por completo o solamente en un área específica. La funcionalizacion consiste en modificar la superficie del sustrato introduciendo grupos funcionales químicos que se enlazarán a dianas específicas.
4. Se ensamblan los dos sustratos, formando una célula con las caras interiores enfrentadas entre sí y con una distancia calibrada (de un micrómetro a varios cientos de micrómetros) entre ambos sustratos.
5. Se introduce la muestra problema, que contiene la diana a detectar en la célula. Las células se pueden llenar por presión positiva o negativa, fuerza centrífuga o capilaridad, dependiendo de la estructura de la célula y su espesor.
6. Se lava el interior de la célula con una disolución tampón adecuada, utilizando alguno de los métodos de llenado del apartado 5.
7. Se introduce el cristal líquido en la célula utilizando alguno de los elementos de flujo descritos más arriba.
8. Se coloca la célula entre polarizadores cruzados para la detección de dianas. También se pueden colocar los polarizadores fijándolos a las caras externas de los sustratos previamente al montaje de la célula.
9. Se observa la célula entre polarizadores cruzados para la detección de las dianas relevantes.

Claims

REIVINDICACIONES
Un dispositivo para la detección amplificada de dianas que comprende: uno o más medios de unión fijados en el dispositivo, con la capacidad de formar un complejo con una diana, medios para iniciar e introducir un flujo de cristal líquido hacia los medios de unión en una dirección preferencial dentro del dispositivo, y medios de polarización de luz configurados para visualizar el alineamiento de dicho cristal líquido.
El dispositivo según la reivindicación 1 , caracterizado porque los medios de unión se seleccionan del grupo que consiste en: anticuerpos, aptámeros, ADN, ARN y proteínas, y fragmentos funcionales de los mismos, que contienen zonas específicas de unión a las dianas.
El dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque la diana está unida a grupos secundarios de forma específica aumentando la sensibilidad de la detección o la especificidad de la diana.
El dispositivo según la reivindicación 3, caracterizado porque dichos grupos secundarios son enzimas.
El dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 4, caracterizado porque dichas uniones específicas a grupos secundarios degradan compuestos específicos del cristal líquido.
El dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, caracterizado porque dichas uniones específicas a grupos secundarios están asociadas a una micropartícula.
El dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el cristal líquido se selecciona del grupo que consiste en cristales líquidos termotrópicos, liotrópicos, liotrópicos cromónicos y mezclas de los mismos.
El dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la diana se selecciona del grupo que consiste en micropartículas, proteínas, ADN, ARN, microorganismos y fragmentos de los mismos.
9. El dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque dichos medios de flujo se seleccionan del grupo que consiste en inyección microfluídica directa, presión positiva, presión negativa, capilaridad, fuerza centrífuga y una mezcla de los mismos.
10. El dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque comprende un primer sustrato plano con una primera cara exterior y una primera cara interior, y un segundo sustrato con una segunda cara exterior y una segunda cara interior en donde al menos uno de los sustratos es total o parcialmente transparente.
1 1 . El dispositivo según la reivindicación 10, caracterizado porque, al menos una de las caras interiores, comprende medios de unión formando una capa de funcionalización, y porque, al menos una de las caras interiores, comprende una capa de alineamiento configurada para inducir el alineamiento de las moléculas del cristal líquido.
12. El dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 10 u 1 1 , caracterizado porque el primer sustrato y el segundo sustrato están separados por una distancia de entre 1 y 1000 μηι.
13. El dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado por comprender dos o más medios de unión distintos con la capacidad de formar complejos con una o más dianas.
14. El dispositivo según la reivindicación 13, caracterizado por comprender dos o más elementos de unión con la capacidad de formar complejos con dos o más dianas específicas distintas.
15. El dispositivo según la reivindicación 14, caracterizado porque cada uno de dichos dos o más medios de unión se encuentra en una región distinta del primer sustrato.
16. El dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque en una de sus regiones no se fijan elementos de unión.
17. El dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque comprende medios de visualización y grabado que se seleccionan entre cámaras, vídeos y lentes.
18. Método para la detección de una diana en una muestra, caracterizado porque comprende (i) poner en contacto la muestra con uno o más medios de unión con capacidad de unirse a dicha diana, (ii) accionar medios de flujo para crear un flujo de cristal líquido que contacte con los medios de unión, (iii) visualizar el alineamiento del cristal líquido mediante medios de luz polarizada, de forma que, en caso de estar la diana presente en la muestra, se observe una o más áreas de desalineamiento en el cristal líquido.
19. El método según la reivindicación 18, caracterizado porque la detección tiene lugar al mismo tiempo que el flujo de cristal líquido.
20. El método según la reivindicación 18, caracterizado porque la detección tiene lugar hasta 60 minutos después de finalizar el flujo de cristal líquido. 21 . El método según cualquiera de las reivindicaciones 19 ó 20, caracterizado porque después de la etapa (i), y antes de la etapa (ii), se lava con una disolución tampón.
22. El método según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21 , caracterizado porque, en dicha muestra, se incuba la muestra con grupos secundarios según reivindicaciones 3, 4 ó 6 antes de la etapa (i).
23. El método según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21 , caracterizado porque, en dicha muestra, se incuba la muestra con grupos secundarios según reivindicaciones 3, 4 ó 6 antes de la etapa (ii).
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