WO2005042142A2 - Thermosensitive, biokompatible polymerträger mit veränderbarer physikalischer struktur für die therapie, diagnostik und analytik - Google Patents

Thermosensitive, biokompatible polymerträger mit veränderbarer physikalischer struktur für die therapie, diagnostik und analytik Download PDF

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Definitions

  • Thermosensitive, biocompatible polymer carrier with changeable physical structure for therapy, diagnostics and analysis
  • the invention relates to biocompatible and thermosensitive polymer carriers of different particle sizes, which enable in vivo application for therapeutic, diagnostic or analytical purposes.
  • Substances in the form of magnetic and / or metallic colloids are encapsulated in the polymer matrix, which can be heated by supplying energy with the aid of a high-frequency magnetic alternating field, which results in a physical change in the structure of the polymer matrix in the form of a configuration change.
  • the invention further relates to the production and use of the polymer carrier.
  • Inductively heatable magnetic polymer particles are known from various publications and patents, for example from publication WO 03/101486 A2, in which inductively heatable thermosensitive polymer supports based on N-isopropylacrylamide and acrylamide derivatives are described, which are based on an inductive one Stimulus to be induced to encapsulated organic substances or Pharma_s_a. release.
  • the isopropylamides described there are the most related. Polymers with thermosensitive properties. They exhibit phase segregation at temperatures above 27 ° C, which is accompanied by a shrinking process. This shrinkage is reversible, ie when the polymer cools below 30 ° C it practically resumes its original shape.
  • This special property of the poly-N-isopropylacrylamide as well as the interesting applications derived from it as a medication depot, biosensor, cell culture substrate, cell encapsulation matrix, actuator or Ventil has long been known and has found expression in a number of publications and patents.
  • the agents or products described in the prior art have in common that they are either not physiologically harmless, or, in the case of non-magnetic polymer carriers, only by means of heat supplied directly from the outside to change the physical structure or shape can be induced or, if they are magnetic carriers, can be structurally altered in any way neither by an external stimulus nor by energy supplied from outside.
  • the w stimulus-response "carriers known from the prior art are either irregular nanoparticles or larger-volume bulk polymers which are not carriers of active substances (phar aka), as contrast agents in NMR diagnostics (magnetic resonance tomograph), suitable as media for molecular separation or as controllable micro tools for in vivo applications.
  • the object of the present invention is to produce thermosensitive and biocompatible polymer supports which are distinguished by high biocompatibility or biodegradability and which can be stimulated in a targeted manner by supplying energy in the form of magnetic induction in such a way that a change in the physical structure due to the resulting heating the polymer matrix is brought about.
  • the polymers are preferably spherical nano- or microparticulate particles or fibers, tubes or threads. Since the configuration change of the polymers according to the invention is in the range of 27-50 ° C., ie also in the range of the body temperature (37 ° C.), these carriers can be used in vivo.
  • an active substance / an active substance is understood to mean a substance which triggers a chemical, biochemical or physiological reaction in some way and can thereby produce a therapeutic, diagnostic and / or prophylactic effect or fulfill an analytical function.
  • Examples include biologically active proteins or peptides, enzymes, antibodies, antigens, nucleic acids, glycoproteins, lectins, oligosaccharides, hormones, lipids, growth factors, interleukins, cytokines, steroids, vaccines, anticoagulants, cytostatic agents, immunomodulatory agents or antibiotics ,
  • the active substances are encapsulated in the polymer particles, which is usually done by directly admixing the active substance in question to the soluble polymer phase.
  • the carriers obtained in this way and loaded with the relevant active substances can then be applied to the desired physiological or bio-analytical active sites using known administration methods such as injection, implantation, infiltration, diffusion, flow or puncture.
  • the location-specific application of the magnetic particles can be further strengthened in that the particles can be placed at the desired locations with the aid of electro-magnets or strong permanent magnets which are applied from the outside to the target or effective location.
  • the polymer particles After the polymer particles have reached their point of action, they can be heated to above body temperature by applying a high-frequency magnetic alternating field, which results in a change in the physical structure of the polymer matrix.
  • “change in the physical structure” defines the change in the original molecular configuration including the conformation due to a swelling or swelling process which leads to a change in the geometric shape, the volume or the particle size of the polymer carrier.
  • the change in volume can change manifest in a shrinking or swelling process with a parallel change in the pore size or in a change in the external shape (geometry) of the polymer.
  • the change in the physical structure can also mean the return of the molecular configuration to its original shape, caused by a heating and cooling process (Freezing process) was changed in the meantime (shape-memory-polymer, "shape-memory-polymer").
  • the change in the physical structure thus triggers a concentrated and rapid release of the encapsulated active ingredients from the matrix.
  • the time it takes for the active substance to diffuse out of the gel basically depends on the size of the polymer carrier (micro or nanoscale) as well as its molar mass, the molar mass of the active substance and that in the polymer. temperature generated by the capsule.
  • nanoscale polymer particles under otherwise analogous conditions asame active substance, temperature, polymer
  • the task of specifically releasing the encapsulated active substances or pharmaceuticals is achieved by heating the thermally sensitive polymers by means of magnetic induction, ie solved by an externally applied high-frequency alternating magnetic field, the magnetic and / or metallic substances encapsulated in the polymer matrix absorbing energy from the magnetic field and thereby being able to heat the polymer carrier above body temperature.
  • Another object of the invention is the production of polymers which shrink at temperatures above body temperature, so that the polymer carriers are applied in a dewaxed (shrunk) state at temperatures above body temperature and return to a swollen state after cooling to body temperature.
  • This phenomenon can be used in the context of therapeutic anti-tumor measures.
  • One of the fatal pathological developments in tumor development is angiogenesis. This is generally understood to mean the widespread formation of blood vessels in the tumor tissue.
  • This pathological process which was previously mainly treated with medication (or surgery), can now are surprisingly suppressed or greatly delayed with the aid of the agents according to the invention.
  • particles preferably with a particle size of 0.3 p to 5 ⁇ m, which have previously been heated to temperatures> 45 ° C.
  • the polymer carriers according to the invention can in particular be used as a matrix for encapsulating active substances and as a means for blocking blood vessels.
  • a further object of the invention is therefore to produce polymer particles which can be used as novel contrast-enhancing agents in the context of NMR diagnostics and in parallel as the basis for a controllable active substance application.
  • superparamagnetic, ferromagnetic or paramagnetic substances can lead to substantial contrast enhancement during imaging in the context of NMR diagnostics (e.g. magnetic resonance imaging, MRI).
  • NMR diagnostics e.g. magnetic resonance imaging, MRI
  • Due to the receptor-specific bioligand coupling to the agents according to the invention more precise diagnoses can be made through better localization and assignment of pathological processes, e.g. Detection of tumors in the early stages and micrometastases can be made possible.
  • a special design of the magnetic field is required with regard to field strength and frequency.
  • commercially available systems consisting of coils through which current flows and which are fed by a high-frequency generator are used.
  • the dimensions of the coils depend on the respective sample sizes and the area to be irradiated; they generally have a diameter of 5 to 30 cm and a length of 5-30 cm.
  • the required output power of the HF generators is normally between 1.5 and 4.5 kW.
  • two generator settings can be selected to heat up the magnetic samples: a) high frequency in the range of 5-20 MHz with low magnetic field strength of 100-500 A / m or b) low frequency of 0.2-0.8 MHz in connection with one high field strength of 1 to 45 kA / m. Both field parameter combinations guarantee sufficient heating output within a short application period ( ⁇ 1 min.). Also for the irradiation of larger voluminous areas, as is the case, for example, with the application of medicinal substances in certain areas of the body, larger coil geometries (30-40 cm diameter) can be used to increase the field strength to> 15kA / m by heating enough Carriers are made available.
  • thermosensitive polymer carriers are magnetic colloids in the form of ferromagnetic, ferrimagnetic or superparamagnetic nano- or microparticles, which have a high magnetization and can be inductively heated in an alternating magnetic field and preferably a Curie temperature of 30 ° C to 100 ° C.
  • the substance preferably used for this purpose is magnetite (Fe 3 0 4 ) or ⁇ -Fe 2 0 3 .
  • the production of such colloids has been adequately described in the literature.
  • iron (III) and iron (II) salt solutions with varying molar ratios (0.5: 1, 2: 1 to 4: 1) are used as the starting point, which then by adding bases or by applying heat to corresponding colloidal magnetic dispersions (“magnetic colloids”).
  • magnetic colloids colloidal magnetic dispersions
  • surface-active substances surfactants, emulsifiers, stabilizers
  • the surface-active substances used are cationic, anionic or non-ionic in nature, such as: oleic acid, lauryl sulfonate, phosphate ester, alcohol ether sulfates, alkylaryl polyether sulfates, alkylaryl polyether sulfonates, citrates, alkyl naphtalenesulfonates, polystyrene sulfonic acid, polyacrylic acid or petrolium sulfonium ethyl (anionic deionic sulfonate) (anionic ammonium sulfonate) (anionic ammonium sulfonate) (anionic ammonium sulfonate) (anionic ammonium sulfonate) (anionic ) and nonylphenoxypolyglycidol, polyvinyl alcohol, kerosene, alkylaryloxypolyethoxyethanols, nonylphenol or polyethylene glycols (non-ionic surfact
  • the particle sizes of the magnetic colloids depend, as is generally known, on various experimental parameters such as the iron salt ratio, the base concentration, the pH and the temperature.
  • the magnetic colloids suitable for the use according to the invention have a particle size of 5-800 ⁇ m, preferably that of 10-200 nm, which ensures that the magnetic colloids are present in colloidally dispersed form during the subsequent encapsulation in the polymer matrix.
  • the magnetic properties and, consequently, the heating properties of the polymer carrier can be controlled in a targeted manner by adding appropriate amounts of the colloid in question.
  • the concentrations of the magnetic colloids in the monomer or polymer batch are generally 10 to 40% by volume, the solids content of the magnetic substance, based on the polymer phase, generally being 5 to 40% by weight, preferably 10 to 30%.
  • metallic colloids can alternatively also be encapsulated in the polymer matrix.
  • all metallic materials in colloidal or finely dispersive form are suitable for this, which can be inductively heated in a high-frequency alternating field. Since the physiological applications in the invented Agents according to the invention represent an essential aspect, preference is given to using inductively heatable metal colloids which are physiologically harmless and / or chemically / physically inert.
  • the metal colloids used for the agents according to the invention generally have a particle size between 5 and 200 ⁇ m.
  • the production of such colloids which have long been used in bioanalytics for the determination of proteins and nucleic acids due to their special absorption properties in the visible range, here especially the gold colloids, are well known from the prior art and the metal colloids or powders are also known also offered commercially in a variety of ways. As is known to those skilled in the art, they are obtained consistently by reducing the corresponding metal salts or by metal spraying processes.
  • Both the metal colloids and the corresponding powders, which are mixed into the polymer batch in the desired concentration, can be used for the agents and processes according to the invention.
  • the proportion of metal in the polymer or in the particles is generally between 5 and 40% by weight.
  • thermosensitive polymers After adding the colloids, it is often advantageous to briefly sonicate the magnetic colloid-polymer mixture with the aid of an ultrasound finger or in an ultrasound bath in order to achieve a fine dispersion of the colloid. Due to the finely dispersed distribution of the colloid, a correspondingly homogeneous heat distribution in the polymer matrix is later possible, which in turn ensures a continuous release of the encapsulated active substance.
  • Polyethylene oxides, polylactides, polyglycolides, polysaccharides, polysaccharide derivatives, polyamino acids, polyethers, chitosan, polyvinyl alcohol, alginate, gelatin or copolymers or block copolymers of these substances are used as thermosensitive substances with high biocompatibility. Depending on the type of polymer, the following processes are used to produce the thermosensitive polymers:
  • Microparticulate pharmaceutical carriers based on poly (lactide) and poly (lactide-co-glycolide) can be produced by the known processes, such as, for example, solvent evaporation, phase separation or spraying processes or the salting-out technique.
  • the basic principle of this procedure is the use of water-soluble organic solvents, for example acetone, which are emulsified in an aqueous phase saturated with a salt.
  • the solvent evaporation process is preferably based on an aqueous solution of the active ingredient to be encapsulated, which is then dispersed in the polymer phase.
  • the active ingredients can also be dispersed directly in the polymer phase.
  • non-solvents preferably vegetable or mineral oils - precipitates the polymer carrier at the border phase.
  • Preferred solvents for the polymers are acetone, benzene and methylene chloride or chloroform for the poly (lactide-co-glycolide) copolymers used.
  • 0.1 to 1 mol% (based on the polymer) of proteins such as serum albumin or synthetic polymers, polyvinyl alcohol or polyvinyl pyrrolidone can be added.
  • the magnetic carriers For the synthesis of the magnetic carriers according to the invention, 5 to 40% by volume, preferably 20-40%, of an organic-based ferrofluid are generally added to the polymer phase.
  • a further advantage of the polymers based on poly (lactide) is their biodegradability over months, the polymer being hydrolyzed within months and the hydrolyzate being subsequently metabolized.
  • thermosensitive, biocompatible polymer supports is derived from poly (ethylene glycol-lactide-ethylene glycol) block copolymers. Their special properties consist in changing from a liquid state to a solid gel-like state above approx. 35 ° C.
  • This phase transition can surprisingly be used to produce thermosensitive, magnetic nanoparticles by dispersing magnetic nanoparticles or magnetic colloids, preferably with a particle size between 5 and 100 nm, in a 10 to 30% aqueous solution of the polymer and then with an ultrasound finger Treated for 10 to 120 seconds at temperatures ⁇ 15 ° C. This creates magnetic particles which are coated with the poly (ethylene glycol lactide ethylene glycol) block copolymers and form stable colloids.
  • these colloids can be used for the treatment of tumors and metastases by injecting the colloids, which are low-viscosity at room temperature, directly into the tumor tissue.
  • the subsequent inductive heating of the colloid to above body temperature (> 37 ° C) causes the colloid to solidify into a gel.
  • the blood supplying vascular systems can be blocked and further tumor growth can be suppressed.
  • further polymers can be produced which meet the criteria of biocompatibility and thermosensitivity according to the invention. This group includes those polymers that are only heat-soluble in a particular solvent, but fail when the solvent cools down.
  • Polymer-solvent systems for the preparation of the corresponding polymers which are suitable for this synthetic engineering are the following examples which in no way limit the invention: polyvinyl alcohol-dimethylfoamamide, polyvinyl alcohol-ethylene glycol, gelatin-water, agarose water, cellulose tributyrate. Ethanol, cellulose acetate butyrate methanol, cellulose acetate butyrate toluene, starch water, cellulose ZnCl 2 solution, collagen water.
  • the polymers dissolved at higher temperatures are dispersed in an organic phase which is not miscible with the polymer phase.
  • Vegetable oils or mineral oils which generally have a viscosity between 40 and 400 cp, are preferably suitable for this. In the subsequent cooling process to room temperature or temperatures ⁇ 40 ° C, these polymers precipitate out as spherical particles.
  • magnetic drug carriers By adding magnetic colloids or ferrofluids, which form stable dispersions with the polymer phase, as well as active substances, e.g. in the form of cytostatics, magnetic drug carriers are obtained.
  • polymer solutions For the synthesis of the polymer supports by means of the suspension precipitation process, 1 to 15% polymer solutions are preferably used.
  • concentration of added magnetic colloid is usually 10 to 40% by volume, based on the polymer phase.
  • Suitable substances which can be incorporated are substances which, with the polymer phases, are stable, homogeneous, i.e. form non-agglomerating colloidal dispersions. For this, e.g. Plasmids, peptides, nucleic acids, oligosaccharides or cytostatics such as Ifosfamide, melphalan, cyclophosphamide, chlorambucil, cisplatin or methotrexate are suitable.
  • the invention is not limiting additives include polyoxyethylene adducts, Alkylsulfosuc ⁇ inate, polyoxyethylene sorbitol esters, polyethylene oxide-propylene oxide block copolymers, alkylphenoxypolyethoxyethanols, Fettalkoholglycolether- organophosphate, sorbitan fatty acid ester, Sucrosestea- rat-palmitate, Fettalkoholpolyethylenglykolether, poly glycerinester, polyoxyethylene alcohols, Polyoxyethylensorbi - Tan fatty acid esters and / or polyoxyethylene acids.
  • Substances of this type are also commercially available, for example, under the trade name Hoostat, Isofol, Synperonic, Span, Tween, Brij, Aerosol OT, Hypermer, Myrj, Triton, Arlacel, Dehymuls, Eumulgin, Renex, Lameform, Pluronic or Tetronic.
  • the particle sizes of ( ⁇ 1 ⁇ m) are particularly suitable for biomedical in vivo applications, since they sustainably support tissue mobility for these applications.
  • Particles with a size of 20-200 ⁇ m are preferably used as contrast agents in NMR diagnostics and as porogens for producing adjustable pore sizes in membranes.
  • particles with a size of 200-800 nm are used particularly as a medicament depot for the targeted application of active substances, for example in the form of therapeutic, diagnostic or prophylactic agents.
  • the suspension process is usually carried out with the aid of a conventional stirrer or a dispersing tool.
  • Particle sizes in the range of 10-500 ⁇ m can be achieved with propeller stirrers with stirring speeds between 600 and 1500 rpm, particle sizes of ⁇ 10 ⁇ m can generally be achieved with stirring speeds of> 1500 rpm.
  • dispersing tools with stirring speeds of> 5000 rpm are used. in question.
  • Mixing tools that work according to the rotor-stator principle are used for this purpose.
  • the dispersions should preferably be prepared under an argon or nitrogen atmosphere or in vacuo in order to largely eliminate the introduction of air which adversely affects the suspension quality.
  • oils as a suspension medium can be dispensed with entirely in a further process approach according to the invention, in which (meth) acrylate-substituted dextrans are used, which are then suspended in a polyethylene glycol phase.
  • ratio of dextran to polyethylene glycol it is possible, as is known from the prior art (Stenekes et al. Pharm. Res., Vol. 15, 557, 1998), to vary the size of the polymer parts which form.
  • the particle large in the case of polyethylene glycol / dextran volume ratios of ⁇ 40 to larger particles > 10 ⁇ m).
  • polymer carriers can be obtained through further variations, including the degree of substitution, the acrylate substituents (eg hydroxyethyl methacrylate, glycidyl methacrlylate) and the molecular weights of the phases used (polyethylene glycol, dextran).
  • the carriers After encapsulation of the corresponding magnetic colloids, as described above, and encapsulation of certain active ingredients (peptides, plasmids, for example), the carriers can be stimulated with the help of magnetic field-induced heating within 5 minutes to give targeted and concentrated active ingredient releases.
  • Liposomes are synthetically produced spherical hollow bodies (vesicles) that are encased in a membrane consisting of a lipid layer or lipid bilayer.
  • the biocompatibility is given by the fact that the lipids constituting the membrane mainly consist of constituents of natural cell membranes. Because of the vesicle structure, the liposomes are particularly well suited to act as active substance carriers by encapsulating pharmaceuticals or other bioactive substances such as peptides or nucleic acids.
  • thermosensitive magnetic liposomes are formed which can be heated to temperatures above 37 ° C. using the magnetic field induction explained above.
  • all natural lipids such as phosphatidylcholine, phosphatidyl acid, cholesterol, phosphatidylethanolamine, monosialogangliosides, phosphatidylinositol, phosphatidylserine and sphingomyelin can be used as lipids.
  • the lipid Compositions vary both in relation to one another and in terms of concentration within certain limits.
  • compositions are: phosphatidylcholine: cholesterol: monosialoganglioside: 2: 1: 0.14; Sphingomyelin: monosialoganglioside 1: 0.07; Sphingomyelin: cholesterol: monosialoganglioside 2: 1: 0.13; Sphingomyelin: phosphatidylcholine: cholesterol: 1: 1: 1; Phosphatidylcholine: Cholesterol: Phosphatidylethanolamine: 1: 1: 0.2. Substitution with lipids that stabilize the membrane conformation, such as sphingomyelin, can reduce phagocytosis by 90%.
  • PEG polyethylene glycol
  • pegylated PEG-phosphatidylethanolamine
  • the molar ratios of the biocompatibility-increasing substituents to the other lipids are preferably between 0.1 and 0.4.
  • a dialysis method known from the prior art (M. De Cuyper et al. Prog. Coll. Poly. Sei. Vol. 82, 353, 1990) is used to produce magnetic liposomes.
  • a ferrofluid stabilized by lauric acid is dialyzed in the presence of a unilamellar lipid vesicle.
  • inductive heating of the magnetic liposomes to temperatures> 45 ° C. changes the lamellar lipid conformation in such a way that encapsulated active ingredients are released to> 60% within 1 to 6 minutes.
  • the vesicle structure breaks down completely, so that the encapsulated active ingredients are fully released within one minute.
  • thermosensitive and biocompatible agents according to the invention also include the group of polyoxyethylenes and polyoxypropylenes and copolymers of these substances with the general formula HO- (CH -CH_0) - (CH (CH -CH.O) - (CH -CH.0) -H ,
  • These polymers also known as poloxamers or Pluronic, have a high degree of biocompatibility on the one hand, and on the other hand they have a pronounced thermosensitivity due to their strong tendency to form hydrogen bonds.
  • the critical phase transition temperatures can be set in the range from 20 to 70 ° C so that the phase transition to temperatures> 40 ° C increases with increasing hydrophilic polyoxyethylene content (usually> 50 mol%) can be moved.
  • An alternative to influencing the phase transition temperature is to add polyhydroxy compounds such as sorbitol, sucrose or glycerin. These compounds shift the gelation point to lower temperatures ( ⁇ 40 ° C), whereas acids or salts such as NaCl, Na 2 S0 3 , Na 2 S0 4 , KC1 shift the phase transition to higher temperatures (> 45 ° C).
  • R1 and R2 mean a polyoxyethylene or polyoxypropylene radical and X is a polyfunctional amine. The syntheses of such copolymers are generally known from the prior art.
  • the production of magnetic micro- or nanoparticles could surprisingly be achieved by adding up to 40 vol.% Of a water-based ferrofluid to the aqueous solutions of these polymers or copolymers.
  • the mixtures are then in an organic phase immiscible with the polymer phase - preferably oils with a viscosity of 40 to 120 cp - with the addition of 0.1 to 2 mol% of a bi- or trifunctional crosslinker. suspended, which is able to cross-link the terminal hydroxyl groups.
  • these are: cyanuric chloride, diisocyanates, epichlorohydrin, dihalides, carbonyldiimidazole.
  • the mechanical suspension of these mixtures can optionally be carried out using a conventional stirrer or, to obtain nanoparticles, advantageously using a dispersing tool (eg T25 Ultraturrax, IKA, FRG) using a stirring speed > 10,000 rpm.
  • a dispersing tool eg T25 Ultraturrax, IKA, FRG
  • the volume ratio of polymer to suspension phase is usually 0.03 to 0.1.
  • thermosensitive and biocompatible polymer supports can also be produced by suspending positively or negatively charged polymers dissolved in aqueous phases in the organic phase and solidifying them by subsequent addition of oppositely charged substances to form discrete spherical polymer parts.
  • examples of this which in no way limit the invention are alginates, chitosan, nucleic acids, proteins, polyamino acids.
  • the polymers are first transferred to a 1 to 10% by weight aqueous solution.
  • a water-immiscible phase e.g. vegetable or silicone oils or chlorinated hydrocarbons, ratio polymer phase / continuous phase: 0.025-0.15
  • the dissolved polymers are crosslinked into spherical particles by adding oppositely charged substances.
  • examples of such crosslinking substances are divalent salts such as Calcium chloride for alginates, nucleic acids and polyamino acids or polyphosphates for chitosan.
  • water-based ferrofluids are added to the polymer solutions, which are able to form stable, colloidally disperse solutions with the polymer phase.
  • positively charged amines such as spermine, spermidine and protamine, which occur in the cells and envelop the DNA, can also be used to produce spherical magnetic particles.
  • a preferred synthetic route for these particles is based on a 0.5 to 10% nucleic acid buffer solution (pH> 8.4). 10 to 40% by volume of a water-based ferrofluid and, optionally, a water-soluble pharmaceutical or bioactive substance are added to the solution.
  • This approach is suspended in a water-immiscible phase, preferably consisting of oils with a viscosity of 60 to 100 cp, with stirring.
  • a water-immiscible phase preferably consisting of oils with a viscosity of 60 to 100 cp
  • the corresponding amines are added, which solidify the nucleic acid suspension into spherical particles.
  • particles with a size between 0.3 and 20 ⁇ m are obtained, with the particle sizes generally increasing with increasing stirring speed (> 3000 rpm) and falling nucleic acid concentration ( ⁇ 5%) be shifted into the nanometer range.
  • nucleic acid carrier By adding 0.1-5% by weight & s (based on the nucleic acid content) of a bioactive, preferably neutral active substance to the nucleic acid solutions, pharmaceutical carriers can be produced which can be treated with an induction coil (15 kA / m, 0.3 MHz, 4.4 kW) are heated within 1 to 5 minutes so that the encapsulated active substance is released up to 70% due to the partial swelling effect of the nucleic acid carrier within the heating period.
  • an induction coil 15 kA / m, 0.3 MHz, 4.4 kW
  • the agents according to the invention offer the possibility of coupling bioaffine ligands such as antibodies, cell receptors, anti-cell receptor antibodies, nucleic acids, oligosaccharides, lectins and antigens to the polymer carriers with which the thermosensitive ven carriers can be bound to certain target substances such as cells, biomolecules, viruses, bacteria or tissue compartments or selectively attach to these target organs according to the known affinity principle.
  • bioaffine ligands such as antibodies, cell receptors, anti-cell receptor antibodies, nucleic acids, oligosaccharides, lectins and antigens
  • the polymer carriers can be specifically coupled to T cells by coupling those antibodies which are directed against the cell surface structures such as, for example, CD2, CD3, CD4, CD8, CD19, CD14, CD15, CD34 and CD45 (“cluster of differentiation”) , B-lymphocytes, monocytes, granulocytes, stem cells and leukocytes
  • CD2, CD3, CD4, CD8, CD19, CD14, CD15, CD34 and CD45 cluster of differentiation
  • B-lymphocytes CD14, CD15, CD34 and CD45
  • monocytes granulocytes
  • stem cells and leukocytes
  • leukocytes ligand-coupled polymer carriers. Examples of these are the polysaccharides, polyvinyl alcohol, gelatin, alginates and polylactides.
  • tumor markers or antigens which do not restrict the invention, are: tumor-associated transplantation antigen (TATA), oncofetal antigen, tumor-specific transplantation antigen (TSTA), p53 protein, carcinoembryonic antigen (CEA), melanoma antigens (MAGE-1 , MAGE-B2, DAM-6, DAM-10), mucin (MUCl), human epidermis receptor (HER-2), alpha-fetoprotein (AFP), helicose antigen (HAGE), human papilloma virus (HPV- E7), Caspase-8 (CASP-8), CD3, CD10, CD20, CD28, CD30, CD25, CD64, Interleukin-2, Interleukin-9, Mamma-CA antigen, prostate-specific antigen (PSA), GD2 antigen,
  • TATA tumor-associated transplantation antigen
  • TSTA tumor-specific transplantation antigen
  • CEA carcinoembryonic antigen
  • MAGE-1 melanoma antigen
  • the corresponding antibodies can be selected either as monoclonal or polyclonal antibodies, as antibody fragments (Fab, F (from 2 ), as single chain molecules (scFv), as “diabodies”, “triabodies”, “minibodies” or bispecific antibodies.
  • Fab antibody fragments
  • F from 2
  • scFv single chain molecules
  • the antitumor agents or cytostatics known from cancer therapy are encapsulated in the polymer particles.
  • examples include: methotrexate, cis-platinum, cyclophosphamide, chlorambucil, busulfan, fluorouracil, doxorubicin, ftorafur or conjugates of these substances with proteins, peptides, antibodies or antibody fragments.
  • Conjugates of this type are known from the prior art: "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy", UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, Reisfeld und Seil, ed., Alan R. Riss, Inc., New York, 1985 ,
  • Coupling agents which are used here are, for example: tresyl chloride, tosyl chloride, cyanogen bromide, carbodiimide, epichlorohydrin, diisocyanate, diisothiocyanate, 2-fluoro-1-methyl-pyridinium-toluene-4-sulfonate, 1,4-butanediol diglycidyl ether , N-hydroxysuccinimide, chlorocarbonate, isonitrile, hydrazide, glutaraldehyde, 1,1 ', carbonyldiidazole.
  • bioligands can also be coupled via reactive heterobifunctional compounds which can form a chemical bond both with the functional groups of the matrix (carboxyl, hydroxyl, sulfhydryl, amino groups) and with the bioligand.
  • examples in the sense of the invention are: succinimidyl-4- (N-maleiimido-methyl) -cyclohexane-1-carboxylate, 4-succinimidyl-oxycarbonyl- - (2-pyridyldithio) toluene, succinimidyl-4- (p-maleimidophenyl) butyrate, N- ⁇ -maleimidobutyryloxysuccinimide ester, 3- (2-pyridyldithio) propionylhydrazide, sulfosuccin imidyl-2- (p-azidosalicylamido) ethyl-l, 3 '-dithiopropionate.
  • the invention is explained in more detail in the following descriptive but not restrictive examples.
  • the particle sizes were determined by scattered light / laser diffraction using a Malvern MasterSizer 2000 (Malvern Instruments, FRG).
  • the mixture is dissolved in 100 ml of vegetable oil preheated to 70 ° C (viscosity 84 cp), in which 1.5% by volume Pluronic 6200, 0.8% by volume Dehymuls HRE and 2% by volume Tween 85 are dissolved, suspended with stirring (2000 rpm).
  • the mixing vessel is cooled down with ice.
  • the polymers precipitate out as pearl-shaped particles.
  • Stirring is continued for 15 minutes.
  • 100 ml of petroleum ether are added and the magnetic fraction is separated using a hand magnet. It is washed ten times alternately with petroleum ether and methanol. After drying in a vacuum to constant weight, magnetic particles with an average particle size of 12 ⁇ m are obtained.
  • the pharmaceutical carriers can be used, among other things, for the treatment of breast cancer.
  • Example 2 The pharmaceutical carriers can be used, among other things, for the treatment of breast cancer.
  • Magnetic chitosan nanoparticles are produced by ionic gelation of chitosan with sodium tripolyphosphate.
  • 3.5 ml of a 0.6% chitosan-glutamate solution (MW: 205 kDa) are dissolved in double-distilled and degassed water, the pH of which has been adjusted to 5.5, with 1.5 ml of one according to Shinkai et al., Biocatalysis, Vol. 5, 61, 1991, prepared aqueous magnetic colloid solution (average particle size 26 nm).
  • 2.8 ml of a 0.084% Na tripolyphosphate solution in which 3 mg / ml gonodropin are dissolved are added dropwise to this dispersion with vigorous stirring (4500 rpm).
  • the magnetic particles are placed on a glass column densely packed with steel wool (filling volume: approx. 4 ml; inner diameter: 0.5 cm), which is surrounded by a 3 cm long ring-shaped neodymium-boron-iron magnet.
  • the mixture is slowly dripped through (0.5 ml / min.). After the run, it is washed ten times with about 20 ml of 30 t of ethanol. This is followed by five washings with 0.1 M Na phosphate buffer, pH 7.2, followed by ten washings. see with bidest. Water.
  • the magnetic polymer fraction on the column is then redistilled with 10 ml after removal of the magnet. Water eluted. The eluate obtained is then freeze-dried.
  • Particles with an average size of 672 nm are obtained.
  • the pharmaceutical carriers can be used for hormone treatment.
  • a 2.8% by weight gelatin solution is prepared by heating to 90 ° C. in 1.5 ml of 0.05 M Na phosphate buffer, pH 7.4. The solution is then brought to 40 ° C. and first 0.5 ml of ferrofluid EMG 507 (from FerroTec, USA) are added. The dispersion is then treated in an ultrasound bath at 40 ° C. for 2 minutes. 1 ml of a 0.05 M Na phosphate buffer solution, pH 7.4, heated to 40 ° C., in which 0.25% human insulin (Sigma) and 0.5% polyvinyl alcohol (Mw: 22 kDa) were dissolved are added to the gelatin ferrofluid dispersion.
  • the resulting mixture is poured into 80 ml vegetable oil preheated to 40 ° C (viscosity 84 cp), in which 0.8 vol% Pluronic L61, 0.8 vol% Tetroni ⁇ 1101 and 2.5 vol% Dehymuls FCE are dissolved, and at 12,000 rpm with Homogenized using a dispersing tool (T25 Ultraturrax, IKA, FRG) under a nitrogen atmosphere for 2 minutes.
  • the dispersion is then cooled to ⁇ 10 ° C. by means of ice cooling, the gelatin particles precipitating.
  • the magnetic fraction is separated using a neodymium-boron-iron hand magnet and washed ten times alternately with petroleum ether and ethanol. This is followed by five washes with ⁇ is water. Polymer particles with an average size of 1.4 ⁇ m are obtained.
  • Example 5 Example 5
  • 1.5 ml of magnetic colloid (2.2 mM Fe / l, average particle size 26 nm), which was produced according to a specification by Shinkai et al., Bio-catalysis, Vol. 5, 61, 1991, are mixed with 5 ml of a 0.05 M Na carbonate buffer solution, pH 9.5, in which 10% of the polyoxyethylene-polyoxypropylene copolymer (Pluro are dissolved, mixed and sonicated for 5 minutes in an ultrasonic bath (500 W) with ice cooling. Nitrogen is then passed into the mixture at 20 ° C. for 15 minutes.
  • the dispersion is then 0.5 ml of 0.05 M Na carbonate buffer solution, pH 9.5, in which 1 wt .-% Somatotro- pin, 0.5% by weight of inositol and 0.05% by weight of human serum albumin are added.
  • the mixture is treated with ultrasound for a further two minutes and then in 50 ml of sesame oil (viscosity 153 cp) in which 2.5% by volume of Span 60 and 1.5% by volume of Dehymuls HRE7 are dissolved, with stirring (1200 rpm) and nitrogen injection Dispersed at 20 ° C. 100 ⁇ l of divinyl sulfone are pipetted in during the dispersing process. The mixture is further stirred over a period of 2 hours.
  • Example 3 Separation and washing processes take place analogously to Example 3. After freeze-drying and dispersion in physiological saline solution, polymer carriers with an average particle size of 0.767 ⁇ m are obtained. When the particles are treated in an alternating magnetic field (magnetic field: 10 kA / m; 0.6 MHz, coil diameter: 5.5 cm, 8 turns), a swelling process is triggered which releases more than 45% of the incorporated hormone within 5 minutes.
  • alternating magnetic field magnetic field: 10 kA / m; 0.6 MHz, coil diameter: 5.5 cm, 8 turns
  • Magnetic liposomes are produced according to the known methods. For this purpose, magnetite magnetic colloids (diameter approx. 15 nm) are first produced and stabilized with lauric acid at 90 ° C. 0.18 ml of this colloid (61 mg Fe 3 0 4 / ml) are mixed with 9 ml of a vesicle dispersion, which is treated by ultrasound treatment with an ultrasound finger (150 W) of a phospholipid-lidocaine mixture of dimyristoylphosphatidylglycerol sodium salt / phosphate idylethanolamine.
  • Polyethylene glycol biotin / lidocaine (concentration: 8.4 ⁇ M / ml molar; ratio 9/1 / 0.5) was obtained, dialyzed for 72 h at 37 ° C (Spectra / Por dialysis tube, Spe ⁇ trum edical Industries, Los Angeles, CA, molecular weight exclusion limit2, 000-14, 000).
  • the dialysis buffer (5 mM N-tris [hydroxymethyl] methyl-2-aminoethanesulfonic acid, TES, pH 7.0) is replaced every 5 hours. Excess vesicles are separated by means of the column filled with steel wool (see Example 3). After the separation, the magnetic fraction is washed several times with 4 ml of TES buffer.
  • the magnetic liposomes are then obtained after removal of the magnet by elution three times with 2 ml of buffer solution each.
  • the molar ratio of phospholipid / Fe 3 0 4 is 0.69.
  • the vesicular structure of the liposomes is dissolved within 5 minutes and the encapsulated lidocaine is released completely ,
  • the pharmaceutical carrier can be used as a local anesthetic.
  • a cobalt ferrite magnetic colloid (CoFe 2 0 4 ) is produced from CoCl 2 and FeCl 3 and in water with the help of a high-performance ultrasound finger (Dr. Hielscher, 80% amplitude) in the presence of 0.75% polyacrylic acid (M w : 5,500) dispersed for 30 seconds.
  • 2 ml of the colloid containing 1.9 mM Fe / ml (particle size 21 nm) are mixed with 5 ml of twice-distilled and degassed water in which 5% by weight of isopropyl cellulose are dissolved. The mixture is sonicated for 10 minutes in an ultrasonic bath at 20 ° C.
  • the mixture is then dissolved in 70 ml vegetable oil preheated to 70 ° C (viscosity 134 cp), in which 1.5% Tween 80, 2.5% Pluronic PE 3100 and 2.5% Span 85 are dissolved, using a stirrer ( 1200 rpm.) Dispersed. Stirring is continued for 10 minutes at this temperature. Solid polymer particles are formed during this process. After adding 100 ml of butanol, the magnetic fraction is separated using a hand magnet and washed several times alternately with petroleum ether and methanol. Magnetic particles with an average particle size of 16 ⁇ m are obtained.
  • 200 mg of the polymer particles produced in this way are mixed with 3 ml of 3.5 M NaOH and 5 ml of epichlorydrine and reacted for 2 hours at 55 ° C. with vigorous stirring.
  • the magnetic particles are then removed using a neodymium-iron-boron magnet. Cut.
  • the product is suspended in approx. 10 ml of water and magnetically separated again. This washing / separating process is repeated 10 times, followed by washing once with acetone.
  • the activated magnetic particle fraction is then reacted with 2 ml of 0.1 M borate buffer, pH 11.4, which contains 10% hexamethylene diamine, at 50 ° C. for 2 hours. After magnetic separation, it is washed ten times with water.
  • the product obtained is then reacted with 2 ml of 0.1 M K-phosphate buffer, pH 7.0, in which 12.5% of glutaraldehyde are dissolved, for 2 h at 30 ° C. It is then washed 20 times with water and then five times with 0.1 M Na phosphate buffer, pH 7.5, over a period of 30 minutes. By incubating 1.5 ml of 0.1 M Na phosphate buffer, pH 7.5, in which 0.2 mg of CD4 are dissolved, for three hours, polymer particles are obtained which can be used to bind the HIV (human immunodeficiency virus). By inductive heating of the virus-magnetic particle complex (4.8 kW, 0.5 MHz) temperatures (> 60 ° C) are reached within 10 minutes, which can kill the viruses.

Abstract

Die Erfindung betrifft biokompatible, thermosensitive Polymere, die durch Einkapselung magnetischer und/oder metallischer Kolloide bzw. magnetischer Nanopartikel mit Hilfe eines hochfrequenten magnetischen Wechselfeldes aufgeheizt werden können. Infolge der induktiven Erwärmung der Polymermatrix werden physikalische Strukturveränderungen in der Polymermatrix ausgelöst, die dazu führen, dass in der Polymermatrix eingekapselte bioaktive Substanzen in kurzer Zeit freigegeben werden. Dieses 'Stimulus-Response'-Prinzip wird zur Herstellung steuerbarer Medikamantendepots, kontrastverstärkender Mittel für die NMR-Diagnostik, manipulierbarer Mikrowerkzeuge, als Mittel zur Blockierung von Blutgefäßen und als steuerbare Porogene bei der Membranherstellung verwendet.

Description

Thermosensitive, biokompatible Polymerträger mit veränderbarer physikalischer Struktur für die Therapie, Diagnostik und Analytik
Die Erfindung betrifft biokompatible und thermosensitive Polymerträger verschiedener Teilchengrößen, die eine in vivo Applikation zu therapeutischen, diagnostischen oder analytischen Zwecken ermöglichen. In die Polymermatrix sind Substanzen in Form magnetischer- und/oder metallischer Kolloide eingekapselt, die sich durch Energiezufuhr mit Hilfe eines hochfrequenten magnetischen Wechselfeldes aufheizen lassen, woraus eine physikalische Strukturveränderung der Polymermatrix in Form einer Konfigurationsänderung resultiert .
Die Erfindung betrifft ferner die Herstellung und Verwendung der Polymerträger.
Indukti-v aufheizbare magnetische Polymerpartikel sind aus diversen Veröffentlichungen und Patenten bekannt, so zum Beispiel aus der Veröffentlichung WO 03/101486 A2, in der induktiv aufheizbare thermosensitive Polymerträger auf der Basis von N-Isopropylacrylamid und Acrylamid-Derivaten beschrieben werden, die aufgrund eines induktiven Stimulus dazu veranlaßt werden, eingekapselte Biosubstanzen oder Pharma_s_a. freizugeben.
Die dort beschriebenen Isopropylamide sind die meist verwandten. Polymere mit thermosensitiven Eigenschaften. Sie weisen bei Temperaturen oberhalb 27 °C eine Phasenentmischung auf, die mit einem Schrumpfungsprozess einhergeht. Diese Schrumpfung ist reversibel, d.h., beim Abkühlen unter 30 °C nimmt das Polymer seine ursprüngliche Form praktisch wieder an. Diese spezielle Eigenschaft des Poly-N- Isopropylacrylamids sowie die sich daraus ableitenden interessanten Anwendungen als Medikamentendepot, Biosensor, Zellkultursubstrat, Zelleinkapselungsmatrix, Aktuator oder Ventil sind seit langem bekannt und haben ihren Ausdruck in einer Reihe von Publikationen und Patentschriften gefunden.
Der Nachteil der dort beschriebenen Mittel ist die Verwen- dung von Acrylamid-Derivaten. Diese Verbindungsklasse ist physiologisch nicht unbedenklich, da bei der Polymerisation nicht auszuschließen ist, dass nicht vollständig abreagierte Monomere oder Oligomere noch in dem Polymeren vorhanden sind. Diese Monomeren gelten als hochtoxisch und können bei einer möglichen in vivo Applikation aus dem Polymeren heraus diffundieren. Insofern sind Wirkstoffträger aus diesen Polymeren für in vivo Applikationen nur sehr eingeschränkt verwendbar.
Die Anmeldung WO 03/101486 A2 stellt gleichzeitig den nächs liegenden Stand der Technik dar und bietet eine gute Übersicht über denselben.
Den weiteren dort zitierten Mitteln und Verfahren ist gemeinsam, daß die magnetische Induktion ausnahmslos zur Erwärmung der Partikel dient, um Zellen oder biologische Organismen per Überwärmung zu zerstören, oder daß sich ihre Funktion ausschließlich aus der komplementären Wechselwirkung eines auf der Matrix gebundenen Bioliganden bzw. - rezeptors mit der zu analysierenden Substanz ableitet . Ihre Einsatzgebiete beschränken sich somit auf die bekannten Felder der Tumorbehandlung sowie Auftrennung und Analyse von Biomolekülen oder der Markierung bestimmter Zellen unter Ausnutzung des klassischen Affinitätsprinzips. S e unterscheiden sich von den erfindungsgemäßen Mitteln also dadurch, daß sie, bedingt durch ihre chemische Struktur , nicht thermosensitiv sind, d.h. nicht in der Lage siid aufgrund eines inneren Wärmestimulus hervorgerufen durclx externe Induktion ihre physikalische Struktur bzw. geometrische Form zu ändern. Diese Eigenschaft stellt jedoch die Grundvoraussetzung dar, Polymerträger als manipulierbare oder steuerbare Mikro- oder Nanoträger bzw. -Werkzeuge nutzen zu können.
Edelmann et al., J. Bio ed. Mat. Res., Vol. 21, 339, 1987, beschreiben ein Ethylen-Vinylaσetat Copolymer, in das millimetergroße Magnete eingebettet sind. Durch ein oszillierendes Magnetfeld wird eingekapseltes Serum Albumin freigesetzt. Da es sich bei dem Polymeren und den eingekapselten Magneten um relativ große makroskopische Gebilde handelt, die nur per Implantation appliziert werden können und danach auch nicht aus dem Körper von selbst ausgeschieden werden, bleiben diesem Verfahren breite in vivo Anwendungen verschlosse .
Zusammenfassend kann gesagt werden, daß den im Stand der Technik beschriebenen Mitteln bzw. Produkten gemeinsam ist, daß diese entweder physiologisch nicht unbedenklich sind, oder, soweit es sich um nicht-magnetische Polymerträger handelt, nur durch direkt von außen zugeführte Wärme zu einer Änderung der physikalischen Struktur oder Form veranlaßt werden können oder, sofern es magnetische Träger sind, weder durch einen äußeren Stimulus noch durch von außen zugeführte Energie strukturell in irgendeiner Weise veränderbar sind. Weiterhin handelt es sich bei den aus dem Stand der Technik bekannten wstimulus-response"-Trägern entweder um unregelmäßige Nanopartikel oder größervolumige Massepolymerisate, die sich nicht als Träger von Wirksubstanzen (Phar aka), als Kontrastmittel in der NMR-Diagnostik (Magnetresonanztomograph) , als Medien für die Molekülauftren- nung oder als steuerbare Mikro erkzeuge für in vivo Applikationen eignen. Aufgabe
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, thermosensitive und biokompatible Polymerträger herzustellen, die sich durch hohe Bioverträglichkeiten oder Bioabbaubar- keiten auszeichnen und die durch Energiezufuhr in Form der magnetischen Induktion gezielt so stimuliert werden können, dass aufgrund der daraus resultierenden Erwärmung eine Änderung der physikalischen Struktur der Polymermatrix herbeigeführt wird. Die Polymere sind vorzugsweise sphärische nano- oder mikropartikuläre Teilchen oder Fasern, Röhren oder Fäden. Da die Konfigurationsveränderung der erfin- dungsgemäßen Polymeren im Bereich von 27- 50 °C liegt, also auch im Bereich der Körpertemperatur (37 °C), können diese Träger in vivo angewendet werden.
Unter Ausnutzung der induktiven Aufheizung werden Dosiersysteme für die Verabreichung bzw. Applikation von Wirksubstanzen für den medizinischen Bereich oder die Analytik geschaffen, die sich im besonderen durch ihre kontaktfreie Steuerbarkeit auszeichnen. Unter einer Wirksubstanz /einem Wirkstoff wird ein Stoff verstanden, der in irgendeiner Weise eine chemische, biochemische oder physiologische Reaktion auslöst und dabei eine therapeutische, diagnostische und/oder prophylaktische Wirkung erzeugen oder eine analytische Funktion erfüllen kann. Beispiele hierfür sind biologisch aktive Proteine oder Peptide, Enzyme, Antikörper, Antigene, Nukleinsäuren, Glykoproteine, Lektine, Oligosac- charide, Hormone, Lipide, Wachstumsfaktoren, Interleukine, Cytokine, Steroide, Vakzine, Antikoagulantien, zytostati- sche Agenzien, immunmodulatorische Agenzien oder Antibiotika. Dazu werden die Wirksubstanzen in die Polymerpartikel eingekapselt, was in der Regel durch direktes Zumischen der betreffenden Wirksubstanz zu der löslichen Polymerphase geschieht . Die so gewonnenen, mit den betreffenden Wirksubstanzen be- ladenen Träger können anschließend mit Hilfe der bekannten Verabreichungsmethoden wie Injektion, Implantation, Infiltration, Diffusion, Strömung oder Punktion an die gewünschten physiologischen oder bio-analytischen Wirkorte appli- ziert werden. Die ortspezifische Applikation der Magnetpartikel kann noch dadurch verstärkt werden, indem die Teilchen mit Hilfe von Elektro- oder starken Permanentmagneten, die von außen an den Ziel- bzw. Wirkort angelegt werden, punktuell an die gewünschten Stellen plaziert werden können. Nachdem die Polymerteilchen ihren Wirkort erreicht haben, können sie durch Anlegen eines hochfrequenten magnetischen Wechselfeldes auf oberhalb Körpertemperatur erwärmt werden, woraus eine Änderung der physikalischen Struktur der Polymermatrix resultiert. Unter „Änderung der physikalischen Struktur" wird dabei erfindungsgemäß die Veränderung der ursprünglichen Molekülkonfiguration einschließlich der Konformation aufgrund eines Quellungs- oder Entquel- lungsprozesses, der zu einer Veränderung der geometrischen Form, des Volumens oder der Teilchengröße des Polymerträgers führt, definiert. Die Volumenänderung kann sich z.B. in einem Schrumpfungs- oder Quellungsprozess mit paralleler Veränderung der Porengröße oder in einer Veränderung der äußeren Form (Geometrie) des Polymeren manifestieren. Die Veränderung der physikalischen Struktur kann auch die Rückkehr der Molekülkonfiguration in seine ursprüngliche Form bedeuten, die durch einen Erwarmungs- und Abkühlungsvorgang (Einfrierprozess) zwischenzeitlich verändert wurde (Form- Gedächtnis-Polymer, „shape-memory-polymer") . Die Änderung der physikalischen Struktur löst somit eine konzentrierte und rasche Freisetzung der eingekapselten Wirkstoffe aus der Matrix aus.
Die Zeit, die die Wirksubstanz benötigt, um aus dem Gel he- rauszudiffundieren, hängt grundsätzlich von der Größe des Polymerträgers (mikro- oder nanoskalig) ab sowie dessen Molmasse, der Molmasse des Wirkstoffes und der in der Poly- merkapsel erzeugten Temperatur ab. In der Regel weisen na- noskalige Polymerpartikel unter sonst analogen Bedingungen (gleiche Wirksubstanz, Temperatur, Polymer) eine um den Faktor 0,1 bis 0,5 geringere Freisetzungszeit auf als entsprechende Mikrogele (>20 um) .
Ein Gegenstand der Erfindung besteht demnach darin, die Polymeren als Träger für therapeutische, analytische oder diagnostische Applikationen nutzbar zu machen und Wirksubstanzen oder Pharmaka in die Polymerträger einzukapseln, um diese nach entsprechender in vivo Verabreichung mit Hilfe der magnetischen Induktion gezielt und steuerbar zu appli- zieren oder auch mittels Magnet an den Wirkort zu bringen.Die Aufgabe der gezielten Freigabe der eingekapselten Wirksubstanzen oder Pharmaka wird durch Erwärmung der ther- mosensitiver Polymeren mittels magnetischer Induktion, d.h. durch ein von außen angelegtes hochfrequentes magnetisches Wechselfeld gelöst, wobei die in die Polymermatrix eingekapselten magnetische und/oder metallische Substanzen aus dem Magnetfeld Energie absorbieren und dadurch den Polymerträger über Körpertemperatur aufheizen können.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Herstellung von Polymeren, die bei Temperaturen oberhalb der Körpertemperatur schrumpfen, so dass die Polymerträger bei Temperaturen oberhalb Körpertemperatur in einem entquollenen (geschrumpften) Zustand appliziert werden und nach Abkühlen auf Körpertemperatur wieder in einen gequollenen Zustand übergehen. Dieses Phänomen läßt sich im Rahmen therapeutischer Antitumor-Maßnahmen anwenden. Eine der fatalen pathologischen Entwicklungen bei der Tumorentwicklung ist die Angiogenese. Hierunter versteht man allgemein eine sich stark ausbreitende Ausbildung von Blutgefäßen im Tumorgewebe. Dieser pathologische Prozess, der bisher vornehmlich medikamentös (oder operativ) behandelt wurde, kann nun überraschenderweise mit Hilfe der erfindungsgemäßen Mittel unterdrückt bzw. stark verzögert werden. Dazu werden Partikel, vorzugsweise mit einer Teilσhengröße von 0,3 p bis 5 μm, die zuvor auf Temperaturen >45 °C aufgeheizt worden sind und damit ihren maximalen Schrumpfgrad erreicht haben, in das Tumorgewebe appliziert. Infolge der anschließenden Adaptation an die Körpertemperatur beginnen die Teilchen wieder zu quellen, um schließlich ihren Gleichgewichts- quellzustand nach einigen Minuten zu erreichen. In diesem gequollenen Zustand üben die Polymerträger eine Embolisati- onsfunktion aus, d.h., sie sind befähigt, die Blutgefäße zu blockieren und dadurch einer Tumorbildung entgegenzuwirken. Diese spezielle Eigenschaft besitzen vor allem Polymere wie z.B. Hydroxyalkylcellulose, Isopropylcellulose, Polyoxye- thylene sowie Poly(ethylenglycol-lactid-glycolid) - Copolymere. Für die Bekämpfung der Angiogenese sind in der Praxis Teilchen mit einer breiten Größenverteilung (0,3 bis 10 um) geeignet, da hierdurch sämtliche Blutgefäßweiten integral erfasst werden können.
Demnach können also die erfindungsgemäßen Polymerträger aufgrund der besonderen Produkt- und Verfahrenskombination im besonderen als Matrix zur Einkapselung von Wirksubstanzen sowie als Mittel zur Blockierung von Blutgefäßen herangezogen werden.
Die Kombination der magnetfeldinduzierten Eirwärmung biokompatibler, thermosensitiver Polymerträger mit paralleler Änderung der physikalischen Struktur bzw. Trägergeometrie eröffnet somit ein Eigensσhaftsspektrum, das über das bisheriger Polymerträgersysteme substantiell hinausgeht.
Mit der zielgerichteten Applikation der erfindungsgemäßen Polymerträger in Verbindung mit einer von außen steuerbaren Strukturveränderung wird überraschenderweise auch die Mög- lichkeit eröffnet, neue integrale Wirkkombinationen zu nutzen.
So ist eine weitere Aufgabe der Erfindung daher, Polymerpartikel herzustellen, die als neuartige kontrastverstärkende Mittel im Rahmen der NMR-Diagnostik und parallel als Basis für eine steuerbare Wirkstoffapplikation verwendet werden können. Wie nach dem bereits diskutiertem Stand der Technik bekannt, können superparamagnetische, ferromagneti- sche oder paramagnetische Substanzen bei der Bildgebung im Rahmen der NMR-Diagnostik (z.B. Magnetresonanztomographie, MRT) zu einer substantiellen Kontrastvertärkung führen. Aufgrund der rezeptorspezifischen Bioligandenkopplung an die erfindungsgemäßen Mittel können genauere Diagnosen durch bessere Lokalisation und Zuordnung pathologischer Prozesse, z.B. Erkennung von Tumoren im Frühstadium und Mi- krometastasen, ermöglicht werden.
Um die vorgenannten magnetischen und metallischen Substanzen bzw. Verbindungen auf die für die analytischen, therapeutischen und diagnostischen Anwendungen relevanten Temperaturen aufheizen zu können, bedarf es einer speziellen Auslegung des Magnetfeldes im Hinblick auf Feldstärke und Frequenz. Es werden in der Regel kommerziell erhältiche Systeme bestehend aus stromdurσhflossenen Spulen, die von einem Hochfrequenzgenerator gespeist werden, benutzt. Die Abmessungen der Spulen richten sich nach den jeweiligen Pro- bengrößen und des zu bestrahlenden Areals; sie weisen allgemein einen Durchmesser von 5 bis 30 cm und eine Länge von 5-30 cm auf. Die erforderliche Ausgangsleistung der HF- Generatoren liegt normalerweise zwischen 1,5 und 4,5 kW. Zum Aufheizen der Magnetproben können grundsätzlich zwei Generatoreinstellungen gewählt werden: a) hohe Frequenz im Bereich von 5-20 MHz bei niedriger Magnetfeldstärke von 100-500 A/m oder b) niedrige Frequenz von 0,2-0,8 MHz in Verbindung mit einer hohen Feldstärke von 1 bis 45 kA/m. Beide Feldparameterkombinationen gewährleisten eine ausreichende Heizleistung innerhalb eines kurzen Applikations- zeitraumes (<1 Min.). Auch für die Bestrahlung größer volumiger Areale, so wie es z.B. bei der Applikation medizinischer Wirkstoffe in bestimmte Körperareale der Fall ist, kann mit größeren Spulengeometrien (30-40 cm Durchmesser) durch entsprechende Erhöhung der Feldstärke auf >15kA/m ausreichend Energie zur Aufheizung der Träger zur Verfügung gestellt werden.
Der Ausgangspunkt für die Synthese der thermosensitiven Polymerträger sind magnetische Kolloide in Form ferromagneti- scher, ferrimagnetischer oder superparamagnetischer Nano- oder Mikropartikel, die eine hohe Magnetisierung aufweisen und sich in einem magnetischen Wechselfeld induktiv aufheizen lassen und vorzugsweise eine Curie-Temperatur von 30 °C bis 100 °C besitzen. Die zu diesem Zweck vorzugsweise verwendete Substanz ist Magnetit (Fe304) oder γ-Fe203. Die Herstellung solcher Kolloide wird in der Literatur hinlänglich beschrieben. Zur Herstellung von Magnetit oder γ-Fe203 wird durchweg von Eisen(III)- und Eisen(II) -Salzlösungen mit variierenden molaren Verhältnissen (0,5:1, 2:1, bis 4:1) ausgegangen, die anschließend durch Zugabe von Basen oder durch Hitzezufuhr in entsprechend kolloidale Magnetdispersionen („Magnetkolloide") überführt werden. Um eine besonders durch die van-der-Waalsλsehen Kräfte bedingte Agglomeration der feinen Magnetpartikel zu verhindern, können oberflächenaktive Stoffe (Tenside, Emulgatoren, Stabilisatoren) zugesetzt werden, die ein Absetzen des Kolloids in einer wäßrigen Dispersion praktisch verhindern. Diese stabilisierten kolloidalen Dispersionen sind auch unter der Bezeichnung „Ferrofluide" bekannt und werden kommerziell angeboten (Ferrofluidics Corp., USA; Advanced Magnetiσs, USA; Taibo Co, Japan; Liquids Research Ltd., Wales; Schering AG, Deutschland) . Die verwendeten oberfächen aktiven Substanzen sind kationischer-, anionischer oder nicht-ionischer Natur wie z.B.: Ölsäure, Laurylsulfonat, Phosphatester, AlkoholetherSulfate, Alkylarylpolyethersulfate, Alkylarylpolyethersulfonate, Zitrate, Alkylnaphtalensulfonate, Polystyrolsulfonsäure, Polyacrylsäure oder Petroliumsulfonate ( anionische Tensi- de) , Dodecyltrimethylammoniumchlorid ( kationisches Tensid) sowie Nonylphenoxypolyglycidol, Polyvinylalkohol, Kerosin, Alkylaryloxypolyethoxyethanole, Nonylphenol oder Polyethy- lenglykole ( nicht-ionische Tenside) .
Die Teilchengrößen der Magnetkolloide hängen, wie allgemein bekannt, von verschiedenen Versuchsparametern wie z.B. dem Eisensalzverhältnis, der Basenkonzentration, des pH-Wertes sowie der Temperatur ab.
Die für die erfindungsgemäße Verwendung geeigneten Magnet- kolloide weisen eine Teilchengröße von 5-800 im, vorzugsweise eine solche von 10-200 nm auf, wodurch gewährleistet ist, daß die Magnetkolloide bei der anschließenden Einkapselung in die Polymermatrix in kolloiddisperser Form vorliegen. Durch gezielte Zudosierung entsprechender Mengen des betreffenden Kolloids lassen sich die magnetischen Eigenschaften und daraus folgend die Aufheizeigenschaften des Polymerträger gezielt steuern.
Die Konzentrationen der Magnetkolloide im Monomer- bzw. Polymeransatz betragen in der Regel 10 bis 40 Vol. %, wobei der Feststoffgehalt der MagnetSubstanz, bezogen auf die Polymerphase, im allgemeinen 5 bis 40 Gew. -%, vorzugsweise 10 bis 30 % beträgt.
Neben den magnetischen Kolloiden können alternativ auch metallische Kolloide in die Polymermatrix eingekapselt werden. Grundsätzlich sind hierfür alle metallischen Werkstoffe in kolloidaler- bzw. fein dispersiver Form geeignet, die sich in einem hochfrequenten Weσhselfeld induktiv aufheizen lassen. Da die physiologischen Applikationen bei den erfin- dungsgemäßen Mitteln einen wesentlichen Aspekt darstellen, werden bevorzugt solche induktiv aufheizbaren Metallkolloide eingesetzt, die physiologisch unbedenklich und/oder chemisch-physikalisch inert sind. Hierzu zählen die Metalle der Gruppe 8 bis 11 (IUPAC Bezeichnung 1986, d.h. Fe, Co, Ni, Cu und höhere Homologe), wobei bevorzugt Gold-, Silber-, Palladium- und Platin-Kolloide oder entsprechende Pulver wegen ihrer Biokompatibilität zum Einsatz gelangen. Die für die erfindungsgemäßen Mittel eingesetzten Metallkolloide weisen in der Regel eine Partikelgröße zwischen 5 und 200 im auf. Die Herstellung solcher Kolloide, die seit langem wegen ihrer speziellen Absorptionseigenschaften im sichtbaren Bereich in der Bioanalytik zur Bestimmung von Proteinen und Nukleinsäuren eingesetzt werden, hier vor allem die Goldkolloide, sind aus dem Stand der Technik hinlänglich bekannt und die Metallkolloide oder -Pulver werden darüber hinaus auch vielfältig kommerziell angeboten. Sie werden, wie dem Fachmann auf diesem Gebiet geläufig, durchweg durch Reduktion der entsprechenden Metallsalze oder durch Metallsprühverfahren gewonnen.
Für die erfindungsgemäßen Mittel und Verfahren können sowohl die Metallkolloide als auch die entsprechenden Pulver eingesetzt werden, die dem Polymeransatz in der gewünschten Konzentration zugemischt werden. Der Metallanteil in dem Polymeren bzw. in den Partikeln beträgt in der Regel zwischen 5 und 40 Gew.-%.
Nach der Zugabe der Kolloide ist es oft von Vorteil, die Magnetkolloid-Polymermischung kurzzeitig mit Hilfe eines Ultraschallfingers oder in einem Ultraschallbad zu beschallen, um eine feine Dispersion des Kolloides zu erreichen. Durch die feindisperse Verteilung des Kolloids ist später eine entsprechend homogene Wärmeverteilung in der Polymermatrix möglich, die ihrerseits eine kontinuierliche Freisetzung der eingekapselten Wirksubstanz gewährleistet. Als thermosensitive Substanzen mit hoher Biokompatibilität kommen Polyethylenoxide, Polylactide, Polyglycolide, Poly- saccharide, Polysaccharid-Derivate, Polyaminosäuren, Poly- ether, Chitosan, Polyvinylalkohol, Alginat, Gelatine oder Copolymere oder Blockcopolymere dieser Substanzen zum Einsatz. Zur Herstellung der thermosensitiven Polymeren kommen je nach Polymerart folgende Verfahren zum Einsatz:
a) Ringöffnende Polymerisation b) Suspensionspräzipitation c) Suspensionsvernetzungsverfahren d) Ionische Vernetzung in Suspension e) Aussalz-Emulsionsverfahren f) Solvent-Evapora ionsverfahren
Diese Verfahren nach dem Stand der Technik sind allgemein bekannt und werden im folgenden in Kontext mit den erfind- gungsgemäßen Polymeren kurz erläutert.
Mikropartikuläre Pharmakaträger auf Poly(lactid) - und Po- ly(laσtid-co-glycolid) -Basis können nach den bekannten Verfahren, so z.B. Solvent-Evaporations-, Phasenseparations- oder Sprühverfahren oder der Aussalztechnik, hergestellt werden. Das grundlegende Prinzip dieser Verfahrensweise ist die Verwendung wasserlöslicher organischer Lösungsmittel, z.B. Aceton, die in einer mit einem Salz gesättigten wäßrigen Phase emulgiert werden. Beim Solvent-Evaporationsver- fahren geht man vorzugsweise von einer wäßrigen Lösung des einzukapselnden Wirkstoffes aus, der anschließend in der Polymerphase dispergiert wird. Alternativ können die Wirkstoffe auch direkt in der Polymerphase dispergiert . Durch anschließende Zugabe von Nichtlösemitteln - vorzugsweise Pflanzen- oder Mineralöle - wird der Polymerträger an der Grenzphase ausgefällt. Als Lösungsmittel für die Polymeren werden vorzugsweise Aceton, Benzol und Methylenchlorid oder Chloroform für die Poly(lactid-co-glycolid) -Copolymeren verwendet. Zur besseren Stabilisierung der Kolloide können 0,1 bis lMol % (bezogen auf das Polymere) Proteine wie z.B. Serum Albumin oder synthetische Polymere, Polyvinylalkohol oder Polyvinylpyrrolidon zugesetzt werden.
Für die Synthese der erfindungsgemäßen magnetischen Träger werden der Polymerphase in der Regel 5 bis 40 Vol%, vorzugsweise 20-40 %, eines Ferrofluides auf organischer Basis zugesetzt. Ein weiterer Vorzug der Polymeren auf Po- ly(lactid) -Basis ist ihre Bioabbaubarkeit über Monate hinweg, wobei das Polymere innerhalb von Monaten hydrolysiert und die Hydrolysatβ anschließend metabolisiert werden.
Eine weitere Gruppe thermosensitiver, biokompatibler Polymerträger leitet sich von Poly(ethylenglyσol-laσtid- ethylenglycol) -Blockcopolymeren ab. Deren besondere Eigenschaften bestehen darin, oberhalb von ca. 35 °C von einem flüssigen Zustand in einen festen gelartigen Zustand überzugehen. Dieser Phasenübergang kann überraschenderweise dazu genutzt werden, thermosensitive, magnetische Nanoparti- kel herzustellen, indem magnetische Nanopartikel bzw. Magnetkolloide, vorzugsweise mit einer Teilchengröße zwischen 5 und 100 nm, in einer 10 bis 30 %igen wäßrigen Lösung des Polymeren dispergiert und anschließend mit einem Ultraschallfinger 10 bis 120 Sekunden bei Temperaturen <15 °C behandelt werden. Dabei entstehen Magnetpartikel, die mit dem Poly(ethylenglycol-lactid-ethylenglycol) - Blockcopolymeren umhüllt sind und stabile Kolloide bilden. Diese Kolloide können aufgrund ihrer besonderen Gelierungs- eigenschaften für die Behandlung von Tumoren und Metastasen genutzt werden, indem die bei Raumtemperatur niederviskosen Kolloide direkt in das Tumorgewebe eingespritzt werden. Durch die anschließende induktive Erwärmung des Kolloids auf oberhalb Körpertemperatur (>37 °C) tritt eine Verfestigung des Kolloids zu einem Gel ein. Infolge der wärmeinduzierten Gelierung können die blutzuführenden Gefäßsysteme blockiert und das weitere Tumorwachstum unterdrückt werden. Mit Hilfe der Suspensionspräzipitation können weitere Polymere hergestellt werden, die die erfindungsgemäßen Kriterien der Biokompatibilität und Thermosensitivität erfüllt. Zu dieser Gruppe zählen solche Polymere, die in einem bestimmten Lösungsmittel nur in der Hitze löslich sind, beim Abkühlen des Lösungsmittels jedoch ausfallen. Polymer- Lösungsmittelsysteme zur Herstellung der entsprechenden Polymere, die für diese Syntheseteehnologie in Frage kommen, sind folgende, die Erfindung in keiner Weise einschränkende Beispiele: Polyvinylalkohol-Dimethylfo__mamid, Polyvinylal- kohol-Ethylenglykol, Gelatine-Wasser, Agarose-Wasser, Cel- lulosetributyrat- Ethanol, Celluloseaσetatbutyrat-Methanol, Celluloseacetatbutyrat-Toluol, Stärke-Wasser, Cellulose- ZnCl2-Lösung, Kollagen-Wasser.
Um zu sphärischen Partikeln zu gelangen, werden die bei höheren Temperaturen gelösten Polymeren in einer nicht mit der Polymerphase mischbaren organischen Phase dispergiert . Pflanzenöle oder Mineralöle, die in der Regel eine Viskosität zwischen 40 und 400 cp aufweisen, sind dafür bevorzugt geeignet. Beim anschließenden Abkühlungsprozess auf Raumtemperatur bzw. Temperaturen <40 °C fallen diese Polymeren als sphärische Partikel aus.
Durch Zumischen magnetischer Kolloide bzw. Ferrofluide, die mit der Polymerphase stabile Dispersionen bilden, sowie Wirkstoffen, z.B. in Form von Zytostatika, werden magnetische Wirkstoffträger erhalten.
Durch die magnetfeldinduzierte Erwärmung dieser Polymerträger kommt es zu einem ausgeprägten Aufquellungsprozess, der eine konzentrierte Freisetzung der eingekapselten Pharmaka zur Folge hat. Die Freisetzungskinetik ist dabei sowohl abhängig von der Molmasse des Polymeren als auch von dem Magnetkolloid-Gehalt, der direkten Einfluß auf die erreichbare Erwärmung ausübt. In der Regel nimmt die Quellfähigkeit mit fallender Molmasse zu und demzufolge steigen auch die Freisetzungsraten der inkorporierten Wirkstoffe.
Für die Synthese der Polymerträger mittels des Suspensions- fällungsverfahrens werden bevorzugt 1 bis 15 %ige Polymerlösungen verwendet. Die Konzentrationen an zugesetztem Magnetkolloid beträgt in der Regel 10 bis 40 Vol%, bezogen auf die Polymerphase. Als inkorporierbare Wirkstoffe kommen solche Substanzen in Frage, die mit den Polymerphasen stabile, homogene, d.h. nicht agglomerierende kolloidale Dispersionen ausbilden. Hierfür sind z.B. Plasmide, Peptide, Nukleinsäuren, Oligosaccharide oder Zytostatika wie z.B. Ifosfamid, Melphalan, Cyclophosphamid, Chlorambucil, Cis- platin oder Methotrexat geeignet.
Zur Verbesserung der Qualität der Suspensionen und Teilchengeometrien (Kugelform) hat sich für alle erfindungsgemäßen Polymerträger als vorteilhaft herausgestellt, den Öl- phasen mindestens eine, in der Regel aber nicht mehr als drei oberflächenaktive Substanzen zuzugeben. Beispiele für solche, die Erfindung nicht einschränkende Zusätze sind: Polyoxyethylenaddukte, Alkylsulfosucσinate, Polyoxyethylen- sorbitolester, Polyethylen-propylenoxid- Blockcopolymere, Alkylphenoxypolyethoxyethanole, Fettalkoholglycolether- Phosphorsäureester, Sorbitan-Fettsäureester, Sucrosestea- rat-Palmitatester, Fettalkoholpolyethylenglykolether, Poly- glycerinester, Polyoxyethylenalkohole, Polyoxyethylensorbi- tan-Fettsäurester und/oder Polyoxyethylensäuren. Substanzen dieser Art sind u.a. auch unter der Warenbezeichnung Ho- staphat, Isofol, Synperonic, Span, Tween, Brij, Aerosol OT, Hypermer, Myrj, Triton, Arlacel, Dehymuls, Eumulgin, Renex, Lameform, Pluronic oder Tetronic im Handel erhältlich. Zur Größenkontrolle der beim Suspensionsprozess gebildeten Polymertröpfchengröße, die unterhalb von (<1 um) liegen sollte, werden der Ölphase 0,05 - 15 Gew.-%, vorzugsweise 0,5 - 5 Gew.-?s, eines oder mehrerer Tenside zugegeben. Die Teilchengrößen von (<1 um) sind vor allem für eine biomedizinische in vivo Applikation geeignet, da sie die Gewe- begängigkeit für diese Anwendungen nachhaltig unterstützen. Partikel mit einer Größe von 20-200 um finden vorzugsweise Anwendung als Kontrastmittel in der NMR-Diagnostik sowie als Porogene zur Erzeugung einstellbarer Porenweiten in Membranen. Partikel mit einer Größe von 200-800 nm werden dagegen besonders als Medikamentendepot zur gezielten Applikation von Wirksubstanzen z.B. in Form therapeutischer, diagnostischer oder prophylaktischer Agenzien verwendet.
Der Suspensionsvorgang wird üblicherweise mit Hilfe eines konventionellen Rührers oder eines Dispergierwerkzeuges bewerkstelligt. Teilchengrößen im Bereich von 10-500 um sind mit Propellerrührer mit Rührgeschwindigkeiten zwischen 600 und 1500 U/min, Teilchengrößen von <10 μm sind in der Regel durch Rührgeschwindigkeiten von >1500 U/min realisierbar. Dagegen kommen für Teilchengrößen <1 μm nur Dispergierwerk- zeuge mit Rührgeschwindigkeiten von >5000 U/min. in Frage. Für diese Zwecke gelangen vor allem Rührwerkzeuge, die nach den Rotor-Stator-Prinzip funktionieren, zur Anwendung. Bei diesen hohen Rührgeschwindigkeiten ist die Herstellung der Dispersionen vorzugsweise unter Argon- oder Stickstoffatmo- sphäre oder im Vakuum durchzuführen, um das Einbringen von Luft, die die Suspensionsqualität negativ beeinflusst, wei- testgehend auszuschalten.
Auf die Verwendung von Ölen als Suspensionsmedium kann in einem weiteren erfindungsgemäßen Verfahrensansatz gänzlich verzichtet werden, in dem von (Meth)acrylat-substituierten Dextranen ausgegangen wird, die anschließend in einer Poly- ethylenglykol-Phase suspendiert werden. Durch Variation des Verhältnisses Dextran zu Polyethylenglykol kann man, wie aus dem Stand der Technik bekannt (Stenekes et al. Pharm. Res., Vol. 15, 557, 1998), die Größe der sich bildenden Po- lymerteilσhen variieren. In der Regel werden die Teilchen- großen bei Polyethylenglykol/Dextran-Volumenverhälnissen von <40 zu größeren Partikeln (>10 μm) verschoben. Durch weitere Variationen u.a. des Substitutionsgrades, der Acry- lat-Substituenten (z.B. Hydroxyethylmethacrylat, Glycidyl- methacrlylat) sowie der Molmassen der verwendeten Phasen (Polyethylenglykol, Dextran) kann eine breite Palette verschiedener Polymerträger gewonnen werden. Nach Einkapselung entsprechender Magnetkolloide, wie sie oben beschrieben sind, und Einkapselung bestimmter Wirkstoffe (Peptide, Plasmide z.B.) können die Träger mit Hilfe der magnetfeldinduzierten Erwärmung innerhalb von 5 Minuten zu einer gezielten und konzentrierten Wirkstofffreigäbe stimuliert werden.
Eine weitere Gruppe biokompatibler und thermosensitiver Trägermedien im Sinne der Erfindung leitet sich von den Li- posomen ab. Liposome sind synthetisch hergestellte kugelförmige Hohlkörper (Vesikel), die aus einer Lipidsσhicht oder Lipid-Doppelschicht bestehenden Membran umhüllt sind. Die Biokompatibilität ist dadurch gegeben, dass die die Membran konstituierenden Lipide überwiegend aus Bestandteilen natürlicher Zellmembranen bestehen. Aufgrund der Vesi- kel-Struktur sind die Liposome besonders gut geeignet, durch Einkapselung von Pharmaka oder anderen bioaktiven Substanzen wie Peptiden oder Nukleinsäuren als Wirkstoffträger zu fungieren. Durch Einkapselung magnetischer Kolloide bzw. Ferrofluide in die Vesikel sowie durch Kombination bestimmter Lipide konnte überraschenderweise gezeigt werden, dass thermosensitive magnetische Liposome gebildet werden, die mit Hilfe der oben erläuterten Magnetfeldinduk- tion auf Temperaturen oberhalb von 37 °C erwärmt werden können. Als Lipide kommen grundsätzlich alle natürlichen Lipide wie z.B. Phosphatidylcholin, Phosphatidylsäure, Cho- lesterin, Phosphatidylethanolamin, Monosialoganglioside, Phosphatidylinosit, Phosphatidylserin und Sphingomyelin in Frage. Wie allgemein bekannt lassen sich die Lipid- Zusammensetzungen sowohl in bezug auf das Verhältnis untereinander als auch hinsichtlich der Konzentration in bestimmten Grenzen variieren. Beispiele für derartige Zusammensetzungen sind: Phosphatidylcholin : Cholesterin : Mono- sialoganglioside: 2 : 1 : 0,14; Sphingomyelin : Monosialo- ganglioside 1 : 0,07; Sphingomyelin : Cholesterin : Mono- sialoganglioside 2 : 1: 0,13; Sphingomyelin : Phosphatidylcholin : Cholesterin: 1 : 1 :1; Phosphatidylcholin : Cholesterin : Phosphatidylethanolamin: 1 : 1 : 0,2. Vor allem durch Substitution mit solchen Lipiden, die die Membrankonformation stabilisieren wie z.B. Sphingomyelin kann die Phagozytose um 90 % verringert werden. Auch mit Polyethy- lengylkol(PEG) -substituierten (pegylierten) Lipiden, PEG- Phosphatidylethanolamin z.B., kann ein analoger Effekt erzielt werden. Die molaren Verhältnisse der biokompatibili- tätssteigernden Substituenten zu den übrigen Lipiden liegen bevorzugt zwischen 0,1 und 0,4.
Zur Herstellung von Magnetliposomen wird ein aus dem Stand der Technik bekanntes Dialyse-Verfahren (M. De Cuyper et al. Prog. Coll. Poly . Sei. Vol. 82, 353, 1990) verwandt. Dazu wird ein durch Laurinsäure stabilisiertes Ferrofluid in Gegenwart eines unilamellaren Lipid-Vesikels dialysiert. Es konnte nun überraschenderweise gezeigt werden, dass sich durch induktive Aufheizung der Magnetliposome auf Temperaturen >45 °C die lamellare Lipidkonformation in der Weise ändert, dass eingekapselte Wirkstoffe innerhalb von 1 bis 6 Minuten zu >60 % freigesetzt werden. Durch weiteres Aufheizen auf >50 °C bricht die VesikelStruktur gänzlich zusammen, so dass die eingekapselten Wirkstoffe innerhalb einer Minute vollständig freigegeben werden.
Zu den erfindungsgemäßen thermosensitiven und biokompatiblen Mitteln gehört auch die Gruppe der Polyoxyethylene und Polyoxypropylene sowie Copolymere dieser Stoffe mit der allgemeinen Formel HO- (CH -CH_0) - (CH(CH -CH.O) - (CH -CH.0) -H. Diese auch unter der Bezeichnung Poloxamere oder Pluronic bekannten Polymere weisen einerseits eine hohe Biokompatibilität auf, andererseits weisen sie aufgrund ihrer starken Neigung Wasserstoffbrücken auszubilden eine ausgeprägte Thermosensitivität auf. Durch gezielte Copolymerisation oder Blockσopolymerisation aus Polyoxyethylen und Polyoxy- propylen lassen sich die kritischen Phasenübergangstempera- turen im Bereich von 20 bis 70 °C so einstellen, dass mit steigendem hydrophilen Polyoxyethylen-Anteil (i.d.R. >50Mol %) der Phasenübergang auf Temperaturen >40 °C verschoben werden kann. Eine Alternative zur Beeinflussung der Phasenübergangstemperatur besteht in der Zugabe von Polyhy- droxyverbindungen wie beispielsweise Sorbit, Sucrose oder Glycerin. Diese Verbindungen verschieben den Gelierungs- punkt zu tieferen Temperaturen (<40 °C) , wohingegen Säuren oder Salze wie z.B. NaCl, Na2S03, Na2S04, KC1 den Phasenübergang zu höheren Temperaturen verschieben (>45 °C) .
Durch Kombination der Polyoxyethylene und Polyoxypropylene mit Di- oder Triaminen, wie z.B. Ethylendiamin, ergibt sich eine weitere Gruppe thermosensitiver, biokompatibler Polymere der allgemeinen Formel: [(R1R2) (R1R2)]=X= [(R1R2) (R1R2)], die auch unter der Bezeichnung Poloxamine bekannt sind. Dabei bedeuten Rl und R2 einen Polyoxyethylen- oder Polyoxy- propylen-Rest und X ein polyfunktionelles Amin. Die Synthesen solcher Copolymeren sind aus dem Stand der Technik allgemein bekannt.
Die Herstellung magnetischer Mikro- oder Nanopartikel konnte überraschenderweise dadurch erreicht werden, dass den wäßrigen Lösungen dieser Polymeren bzw. Copolymeren bis zu 40Vol.- % eines Ferrofluides auf Wasserbasis zugemisσht werden. Die Mischungen werden sodann in einer mit der Poly- merphase nicht mischbaren organischen Phase - vorzugsweise Öle mit einer Viskosität von 40 bis 120 cp - unter Zugabe von 0,1 bis 2 Mol % eines bi- oder trifunktionellen Vernet- zers suspendiert, der in der Lage ist, die endständigen Hydroxylgruppen zu vernetzen. Beispiele hierfür sind: Cya- nurchlorid, Diisocyanate, Epichlorhydrin, Dihalogenide, Carbonyldiimidazol Das mechanische Suspendieren dieser Mischungen kann wahlweise mit einem herkömmlichen Rührer oder, zur Erzielung von Nanopartikeln, vorteilhaft mit einem Dispergierwerkzeug (z.B. T25 Ultraturrax, IKA, BRD) unter Anwendungen einer Rührgeschwindigkeit >10.000 U/min durchgeführt werden. Das Volumenverhältnis Polymer- zu Suspensionsphase beträgt in der Regel 0,03 bis 0,1.
Thermosensitive und biokompatible Polymerträger können überraschenderweise auch dadurch hergestellt werden, dass in wäßrigen Phasen gelöste positiv oder negativ geladener Polymere in organischer Phase suspendiert und durch anschließende Zugabe entgegengesetzt geladener Substanzen zu diskreten sphärischen Polymerteilσhen verfestigt werden. Die Erfindung in keiner Weise einschränkende Beispiele hierfür sind Alginate, Chitosan, Nukleinsäuren, Proteine Polyaminosäuren. Dazu werden die Polymeren zunächst in eine 1 bis 10 Gew.-ssige wäßrige Lösung überführt. Während der anschließenden Suspension in einer mit Wasser nicht mischbaren Phase (z.B. Pflanzen- oder Siliconöle oder chlorierte Kohlenwasserstoffe, Verhältnis Polymerphase/ kontinuierliche Phase: 0,025-0,15) werden durch Zugabe entgegengesetzt geladener Substanzen die gelösten Polymeren zu sphärischen Partikeln vernetzt. Beispiele für solche vernetzend wirkenden Substanzen sind zweiwertige Salze wie z.B. Kalziumσhlo- rid bei Alginaten, Nukleinsäuren und Polyaminosäuren oder Polyphosphate bei Chitosan.
Für die Synthese magnetischer Träger werden den Polymerlösungen Ferrofluide auf Wasserbasis zugesetzt, die mit der Polymerphase stabile, kolloiddisperse Lösungen zu bilden in der Lage sind. Überraschenderweise können darüber hinaus auch positiv geladene Amine wie z.B. Spermin, Spermidin und Protamin, die in den Zellen vorkommenden und die DNA umhüllen, zur Herstellung sphärischer Magnetpartikel herangezogen werden. Ein bevorzugter Syntheseweg dieser Partikel geht dabei von einer 0,5 bis 10 %igen Nukleinsäure-Pufferlösung (pH >8,4) aus. Der Lösung werden 10 bis 40 Vol.- % eines Ferrofluids auf Wasserbasis sowie wahlweise ein wasserlösliches Pharma- kon oder bioaktive Substanz zugesetzt. Dieser Ansatz wird in einer mit Wasser nicht-mischbaren Phase, vorzugsweise bestehend aus Ölen mit einer Viskosität von 60 bis 100 cp, unter Rühren suspendiert. Während des Suspensionsvorganges werden unter Zugabe von 0,1 bis 3 Mol %, bezogen auf den Nukleinsäuregehalt, die entsprechenden Amine zugesetzt, die die Nukleinsäure-Suspension zu sphärischen Partikeln verfestigen. Es fallen je nach Rührbedingungen und Nukleinsäure- Konzentrationen Partikel mit einer Größe zwischen 0,3 und 20 μm an, wobei in der Regel die Teilchengrößen mit steigender Rührgeschwindigkeit (>3000 U/min) und fallender Nu- kleinsäure-Konzentration (<5 %) in den Nanometer-Bereich hin verschoben werden. Durch Zugabe von 0,l-5Gew.-s& (bezogen auf den Nukleinsäure-Anteil) einer bioaktiven, vorzugsweise neutralen Wirksubstanz zu den Nukleinsäure-Lösungen lassen sich Pharmakaträger herstellen, die mit einer Induktionsspule (15 kA/m, 0,3 MHz, 4,4 kW) innerhalb von 1 bis 5 Minuten so aufgeheizt werden, dass die eingekapselte Wirksubstanz aufgrund des partiellen Aufquelleffektes des Nu- kleinsäure-Trägers innerhalb der Aufheizperiode bis zu 70 % freigesetzt wird.
Neben der magnetfeldinduzierten Freigabe eingekapselter Pharmaka oder bioaktiver Substanzen bieten die erfindungsgemäßen Mittel die Möglichkeit, bioaffine Liganden wie Antikörper, Zellrezeptoren, Anti-Zellrezeptor-Antikörper, Nukleinsäuren, Oligosaccharide, Lektine und Antigene an die Polymerträger zu koppeln, mit denen sich die thermosensiti- ven Träger an bestimmte Zielsubstanzen wie Zellen, Biomoleküle, Viren, Bakterien oder Gewebekompartimente binden lassen bzw. sich an diese Zielorgane gemäß dem bekannten Affinitätsprinzip selektiv anlagern. So lassen sich die Polymerträger durch Ankopplung solcher Antikörpern, die gegen die Zelloberflächenstrukturen wie z.B. CD2, CD3, CD4, CD8, CD19, CD14, CD15, CD34 und CD45 („cluster of differentiati- on") gerichtet sind, spezifisch an T-Zellen, B-Lymphozyten, Monozyten, Granulozyten, Stammzellen und Leukozyten anlagern. Für die zielgerichtete Applikation mittels liganden- gekoppelter Polymerträger kommen vor allem die erfindungs- gemäßen Mittel in Frage, die über funktionelle Gruppen in Form von Carboxyl-, Hydroxyl- oder Aminogruppen verfügen. Beispiele hier für sind die Polysaccharide, Polyvinylalko- hol, Gelatine, Alginate und Polylactide.
Durch Kopplung solcher Antikörper bzw. Antikörper-Fragmente, die gegen ein Tumorzellantigen gerichtet sind, ist zunächst die Voraussetzung geschaffen, die Polymerträger zielgerichtet im Tumorgewebe zu konzentrieren bzw. an die Tumorzellen anzulagern. Beispiele für solche, die Erfindung jedoch nicht einschränkende Tumormarker bzw. -Antigene sind: tumorassoziiertes Transplantationsantigen (TATA) , On- kofetales Antigen, tumorspezifisches Transplantationsantigen (TSTA) , p53-Protein, carzinoembryonales Antigen (CEA) , Melanom-Antigene (MAGE-1, MAGE-B2, DAM-6, DAM-10), Mucin (MUCl), humaner Epidermis Rezeptor (HER-2), alpha- Fetoprotein (AFP), Helicose-Antigen (HAGE), humanes Papil- loma Virus (HPV-E7), Caspase-8 (CASP-8), CD3, CD10, CD20, CD28, CD30, CD25, CD64, Interleukin-2, Interleukin-9, Mam- ma-CA-Antigen, Prostata-spezifisches Antigen (PSA) , GD2- Antigen, Melanocortin-Rezeptor (MCIR), 138H11-Antigen. Die entsprechenden Antikörper können dabei wahlweise als mo- noklonale oder polyklonale Antikörper, als Antikörper- Fragmente (Fab, F(ab 2), als Einzelkettenmoleküle (scFv), als „Diabodies", „Triabodies", „Minibodies" oder bispezifische Antikörper eingesetzt werden.
Zur parallelen Behandlung der Tumore werden die aus der Krebstherapie bekannten Antitumormittel bzw. Zytostatika in die Polymerpartikel eingekapselt. Beispiele hierfür sind: Methotrexat, Cis-Platin, Cyclophosphamid, Chlorambucil, Busulfan, Fluorouracil, Doxorubicin, Ftorafur oder Konjugate dieser Substanzen mit Proteinen, Peptiden, Antikörpern oder Antikörperfragmenten. Konjugate dieser Art sind aus dem Stand der Technik bekannt: „Monoclonal Antibodies and Can- cer Therapy", UCLA Symposia on Molecular and Cellular Bio- logy, Reisfeld und Seil, Hrsg., Alan R. Riss, Inc., New York, 1985.
Für die kovalenten Anbindung der Bio- bzw. Affinitätsliganden oder Rezeptoren an die Polymerträger werden die bekannten Methoden zur Kopplung bioaktiver Substanzen wie Proteine, Peptide, Oligosaccharide oder Nukleinsäuren an feste Träger genutzt. Kopplungsagenzien, die hier zum Einsatz gelangen, sind z.B.: Tresylchlorid, Tosylchlorid, Bromcyan, Carbodiimide, Epichlorhydrin, Diisocyanat, Diisothiocyana- te, 2-Fluor-l-methyl-pyridinium-toluol-4-sulfonat, 1,4- Butandiol-diglycidyläther, N-Hydroxysuccinimid, Chlorcarbo- nat, Isonitril, Hydrazid, Glutaraldehyd, 1,1', -Carbonyl- dii idazol. Darüber hinaus lassen sich die Bioliganden auch über reaktive heterobifunktionelle Verbindungen, die sowohl mit den funktioneilen Gruppen der Matrix (Carboxyl-, Hydro- xyl-, Sulfhydryl-, Aminogruppen) als auch mit dem Bioliganden eine chemische Bindung eingehen können, koppeln. Beispiele im Sinne der Erfindung sind: Succinimidyl-4- (N- maleiimido-methyl) -cyclohexan-1-carboxylat, 4-Succinimidyl- oxycarbonyl- - (2-pyridyldithio) toluol, Succinimidyl-4- (p- maleimidophenyl)butyrat, N-γ-Maleimidobutyryloxysuccinimid- ester, 3- (2-Pyridyldithio)propionylhydrazid, Sulfosuccin- imidyl-2- (p-azidosalicylamido)ethyl-l,3 '-dithiopropionat . Ein Fachmann auf diesem Gebiet kann diese Kopplungsagenzien jeder Zeit entsprechend den Angaben in „G.T. Hermanson, „Bioconjugate Techniques", Academic Press, San Diego, 1996 nutzen.
Die Erfindung wird in den nachfolgenden beschreibenden, aber nicht einschränkenden Beispielen näher erläuter . Die Teilchengrößen wurden durch Streulicht/Laserbeugung mit einem Malvern MasterSizer 2000 (Malvern Instruments, BRD) bestimmt.
Beispiel 1
2,8 g Polyvinylalkohol, Molmasse 204 kDa, werden in 18 ml Ethylenglykol bei 120 °C gelöst. Nachdem die Lösung auf 80 °C heruntergekühlt ist, werden der Lösung 5 ml eines mit Laurinsäure stabilisierten Ferrofluides zugesetzt. Es folgt eine fünfminütige Behandlung im Ultraschallbad. Danach läßt man die Dispersion auf 65 °C herunter kühlen. Nachdem 50 mg Melphalan in der Polymerphase gelöst wurden, wird die Mischung in 100 ml auf 70 °C vorgeheiztem Pflanzenöl (Viskosität 84 cp), in dem 1,5 Vol% Pluronic 6200, 0,8 Vol% Dehymuls HRE und 2Vol% Tween 85 gelöst sind, unter Rühren (2000 U/min) suspendiert. Während des Suspensionsvorganges wird das Rührgefäß mit Eis heruntergekühlt. Nach ca. 3 Minuten fallen die Polymere als perlförmige Teilchen aus. Es wird 15 Minuten weitergerührt. Danach werden 100 ml Petrolether zugefügt und die magnetische Teilσhenfraktion mit Hilfe eines Handmagneten abgetrennt. Es wird lOmal abwechselnd mit Petrolether und Methanol nachgewaschen. Nach Trocknung im Vakuum bis zur Gewichtskonstanz fallen Magnetpartikel mit einer mittleren Teilchengröße von 12 μm an.
Die Pharmakaträger können u.a. zur Behandlung von Mammakar- zinomen eingesetzt werden. Beispiel 2
500 mg eines analog der Vorschrift von B. Jeong et al., Colloid Surfaces B Biointerfaces Vol. 16, 185, 1999, hergestellten Triblockcopolymeren, bestehend aus Poly(ethylenglycol-laσtid-ethylenglycol) (Mw: 11.8 KDa) , werden in 4 ml 0,1 M Na-Phosphat-Puffer, pH 7,4, gelöst und anschließend 5 Min. bei 15 °C in einem Ultraschallbad beschallt. Zu dieser Lösung werden 100 mg Kobalt-Ferrit- Pulver (CoFe204, mittlere Teilchengröße 259 nm) , das aus CoCl2 und FeCl3 hergestellt vmrde, zugegeben. Die Dispersion wird sodann unter Eiskühlung mit Hilfe eines Hochleistungs- ultraschallfinger (Fa. Dr. Hielscher, 80 % Amplitude) dreimal für 50 Sek. unter Eiskühlung und Stickstoffatmosphäre beschallt. Es entsteht ein stabiles Kolloid mit einer mittleren Teilchengröße von 645 nm.
Beispiel 3
Magnetische Chitosan Nanopartikel werden durch ionische Gelierung von Chitosan mit Na-Tripolyphosphat hergestellt. 3,5 ml einer 0,6 %igen Chitosan-Glutamat-Lösung (MW: 205 kDa) werden in doppelt destilliertem und entgastem Wasser, dessen pH auf 5,5 eingestellt wurde, mit 1,5 ml einer nach Shinkai et al., Biocatalysis, Vol. 5, 61, 1991, hergestellten wäßrigen Magnet-Kolloid-Lösung (mittlere Teilchengröße 26 nm) versetzt. Zu dieser Dispersion werden 2,8 ml einer 0,084 %igen Na-Tripolyphosphat Lösung, in der 3 mg/ml Gona- dotropin gelöst sind, unter starkem Rühren (4500 U/min) tropfenweise zupipettiert . Nach zweiminütigem Rühren werden die Magnetteilchen auf eine mit Stahlwolle dichtgepackte Glassäule (Füllvolumen: ca. 4 ml; Innendurchmesser: 0,5 cm) , die von einem 3 cm langen ringförmigen Neodym-Bor- Eisen-Magneten umgeben ist, aufgegeben. Man läßt die Mischung langsam (0,5 ml/Min.) durchtropfen. Nach dem Durchlauf wird zehnmal mit ca. 20 ml 30 ti ern Ethanol nachgewaschen. Dem schließt sich fünfmaliges Waschen mit 0,1 M Na- Phosphat-Puffer, pH 7.2, an, gefolgt von zehnmaligem Wa- sehen mit bidest. Wasser. Die magnetische Polymerfraktion auf der Säule wird sodann nach Wegnahme des Magneten mit 10 ml bidest. Wasser eluiert. Das gewonnene Eluat wird anschließend gefriergetrocknet .
Es fallen Teilchen mit einer mittleren Größe von 672 nm an. Die Pharmakaträger können nach entsprechender Dispersion in physiologischer Kochsalzlösung zur Hormonbehandlung eingesetzt werden.
Beispiel 4
Eine 2,8 Gew.-ssige Gelatine-Lösung wird durch Erwärmen auf 90 °C in 1,5 ml 0,05 M Na-Phosphat-Puffer, pH 7,4, hergestellt. Danach wird die Lösung auf 40 °C gebracht und zunächst werden 0,5 ml Ferrofluid EMG 507 (Fa. FerroTec, USA) zugegeben. Die Dispersion wird danach 2 Minuten bei 40 °C im Ultraschallbad behandelt. 1 ml auf 40 °C erwärmte 0,05 M Na-Phosphat-Puffer-Lösung, pH 7,4, in der 0,25 % Human Insulin (Fa. Sigma) sowie 0,5 % Polyvinylalkohol (Mw: 22 kDa) gelöst sind, wird zu der Gelatine-Ferrofluid-Dispersion zugegeben. Die resultierende Mischung wird in 80 ml, auf 40 °C vorgewärmtes Pflanzenöl (Viskosität 84 cp) , in dem 0.8Vol% Pluronic L61, 0.8Vol% Tetroniσ 1101 und 2.5Vol% Dehymuls FCE gelöst sind, gegeben und bei 12.000 U/min mit Hilfe eines Dispergierwerkzeuges (T25 Ultraturrax, IKA, BRD) unter Stickstoffatmosphäre 2 Minuten homogenisiert. Danach wird die Dispersion mittels Eiskühlung auf <10 °C heruntergekühlt, wobei die Gelatinepartikel ausfallen. Nach Zugabe von 50 ml Petrolether wird die magnetische Fraktion mittels eines Neodym-Bor-Eisen Handmagneten abgetrennt und zehnmal abwechselnd mit Petrolether und Ethanol nachgewaschen. Danach erfolgt fünfmaliges Waschen mit Ξiswasser. Es werden Polymerteilchen mit einer mittleren Größe von 1,4 μm gewonnen. Beispiel 5
80 mg eines nach einer Vorschrift von Zweers et al. (J. Biomed. Mater. Res. Part B, Vol. 66B, 559, 2002) hergestellten und im Vakuum getrockneten Poly(lactid-co- glycolid)s (Mw 110 kDa), werden in 4 ml Aceton gelöst. Der Lösung werden 1,5 ml des Ferrofluids DKS1S21 (Fa. Liquids Research Ltd., Wales) sowie 8 mg Cyclophosphamid zugefügt. Die Mischung wird anschließend mit Hilfe eines Dispergier- werkzeuges (T25 Ultraturrax, IKA, BRD) bei 20.000 U/min. in 8 ml Wasser, in dem 60 Gew.-% MgCl2 und 2 Gew.-?s Polyvinyl- alkohol (Mw 22 kDa) als Stabilisator gelöst sind, eine Minute bei Raumtemperatur dispergiert . Während des Emulgier- vorganges werden 7,5 ml Wasser zugesetzt und der Rührvorgang wird für 20 Sekunden fortgesetzt. Danach erfolgt die Hochgradientenmagnetfeld-Separation analog Beispiel 3. Nach dem Durchlauf (0,5 ml/Min.) wird zehnmal mit ca. 20 ml bidest. Wasser nachgewaschen. Der auf der Säule retendierte magnetische Polymerträger wird sodann nach Wegnahme des Magneten dreimal mit jeweils 1,5 ml physiologischer Kochsalzlösung eluiert. Es werden Nanopartikel mit einer mittleren Teilchengröße von 483 nm gewonnen. Die eingekapselten für die Tumortherapie einsetzbaren Pharmaka können mit Hilfe eines hochfrequenten Magnetfeldes (10 kA/m, 0,8 MHz, 4,8 kW) innerhalb von 5 Minuten zu >50 % freigesetzt werden.
Beispiel 6
1,5 ml Magnetkolloid (2,2 mM Fe/ l, mittlere Teilchengröße 26 nm) , das nach einer Vorschrift von Shinkai et al., Bio- catalysis, Vol. 5, 61, 1991, hergestellt wurde, werden mit 5 ml einer 0,05 M Na-Carbonat-Pufferlösung, pH 9,5, in der 10 % des Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Copolymeren (Pluro-
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gelöst sind, vermischt und 5 Min. in einem Ultraschallbad (500 W) unter Eiskühlung beschallt. In die Mischung wird sodann für 15 Minuten bei 20 °C Stickstoff eingeleitet. Der Dispersion werden sodann 0,5 ml 0,05 M Na- Carbonat-Puffer-Lösung, pH 9,5, in der 1 Gew.-% Somatotro- pin, 0,5 Gew.-% Inosit und 0,05 Gew.-% Human Serum Albumin gelöst sind, zugefügt. Die Mischung wird weitere zwei Minuten mit Ultraschall behandelt und dann in 50 ml Sesamöl (Viskosität 153 cp) in dem 2,5 Vol% Span 60 und 1,5 VolSs Dehymuls HRE7 gelöst sind, unter Rühren (1200 U/min) und Stickstoffeinleitung bei 20 °C dispergiert. Während des Dispergiervorganges werden 100 μl Divinylsulfon zupipettiert. Die Mischung wird über einen Zeitraum von 2 Stunden weiter gerührt. Separation sowie Wasσhprozesse erfolgen analog Beispiel 3. Nach Gefriertrocknung und Dispersion in physiologischer Kochsalzlösung fallen Polymerträger mit einer mittleren Teilchengröße von 0,767 μm an. Bei der Behandlung der Teilchen in einem magnetischen Wechselfeld (Magnetfeld: 10 kA/m; 0,6 MHz, Spulendurchmesser: 5,5 cm, 8 Windungen) wird ein Entquellungsprozess ausgelöst, der innerhalb von 5 Minuten mehr als45 % des inkorporierten Hormons freisetzt.
Beispiel 7
Magnetliposome werden gemäß den bekannten Verfahren hergestellt. Dazu werden zunächst Magnetit-Magnetkolloide (Durchmesser ca. 15 nm) hergestellt und mit Laurinsaure bei 90 °C stabilisiert. 0,18 ml dieses Kolloides (61 mg Fe304/ml) werden mit 9 ml einer Vesikel Dispersion, die durch Ultraschallbehandlung mittels eines Ultraschallfingers (150 W) einer Phospholipid-Lidocain-Mischung Dimyri- stoylphosphatidylglycerin Na-Salz/Phospha idylethanolamin- Polyethylengycol-biotin/Lidocain (Phospholipid- Konzentration: 8,4μM/mlmolares; Verhältnis 9/1/0,5) erhalten wurde, für 72 h bei 37 °C dialysiert (Spectra/Por Dialyse Röhrchen, Speσtrum edical Industries, Los Angeles, CA, Molmassen-Ausschlußgrenzel2, 000-14, 000) . Der Dialsyse- Puffer (5 mM N-tris [hydroxymethyl]methyl-2- aminoethanesulfonsäure, TES, pH 7.0) wird alle 5 Stunden ausgewechselt. Überschüssige Vesikel werden mittels der Stahlwolle gefüllten Kolonne (s. Beispiel 3) abgetrennt. Nach der Separation wird die Magne fraktion mehrfach mit 4 ml TES-Puffer nachgewaschen. Danach werden die Magne liposome nach Entfernen des Magneten durch dreimalige Elution mit je 2 ml Puffer-Lösung erhalten. Das molare Verhältnis Phospholipid/ Fe304 beträgt 0.69. Bei der anschließenden Behandlung der Teilchen in einem magnetischen Wechselfeld (Magnetfeld: 10 kA/m; 0,6 MHz, Spulendurchmesser: 5,5 cm, 8 Windungen) wird die vesikuläre Struktur der Liposome innerhalb von 5 Minuten aufgelöst und das eingekapselte Lidocain vollständig freigesetzt. Der Pharmakaträger kann als Lokalanästhetikum verwendet werden.
Beispiel 8
Ein Kobalt-Ferrit-Magnetkolloid (CoFe204) wird aus CoCl2 und FeCl3 hergestellt und in Wasser mit Hilfe eines Hochleistungsultraschallfinger (Fa. Dr. Hielscher, 80 % Amplitude) in Gegenwart von 0,75 % Polyaσrylsäure (Mw: 5,500) 30 Sek. dispergiert. 2 ml des 1,9 mM Fe/ml enthaltenden Kolloides (Teilchengröße 21 nm) werden mit 5 ml zweimal destilliertem und entgastem Wasser, in dem 5 Gew. -% Isopropylcellulose gelöst sind, vermischt. Die Mischung wird für 10 Minuten im Ultraschallbad bei 20 °C beschallt. Danach wird die Mischung in 70 ml auf 70 °C vorgeheiztes Pflanzenöl (Viskosität 134 cp), in dem 1,5 % Tween 80, 2,5 % Pluronic PE 3100 und 2,5 % Span 85 gelöst sind, mit Hilfe eines Rührers (1200 U/min.) dispergiert. Es wird 10 Minuten bei dieser Temperatur weitergerührt. Während dieses Vorganges werden feste Polymerpartikel gebildet. Nach Zugabe von 100 ml Bu- tanol wird die Magnetfraktion mittels eines Handmagneten abgetrennt und mehrfach abwechselnd mit Petrolether und Methanol nachgewaschen. Es werden Magnetpartikel mit einer mittleren Teilchengröße von 16 μm erhalten.
200 mg der so hergestellten Polymerpartikel werden mit 3 ml 3.5 M NaOH und 5 ml Epichlorydrin versetzt und 2 h bei 55 °C unter intensivem Rühren umgesetzt. Danach werden die Magnetpartikel mittels eines Neodym-Eisen-Bor-Magneten ab- getrennt. Das Produkt wird in ca.10 ml Wasser suspendiert und nochmals magnetisch abgetrennt. Dieser Wasch/Abtrennvorgang wird lOmal wiederholt, gefolgt von einmaligem Waschen mit Aceton. Die aktivierte Magnetpartikelfraktion wird sodann mit 2 ml 0.1 M Borat-Puffer, pH 11.4, der 10 % Hexamethylendiamin enthält, bei 50 °C 2 h umgesetzt. Nach magnetischer Abtrennung wird zehnmal mit Wasser nachgewaschen. Das gewonnene Produkt wird anschließend mit 2 ml 0.1 M K-Phosphat-Puffer, pH 7.0, in dem 12.5 % Glutaraldehyd gelöst sind, für 2 h bei 30 °C zur Reaktion gebracht. Anschließend wird über einen Zeitraum von 30 Minuten zunächst 20mal mit Wasser und dann fünfmal mit 0.1 M Na-Phosphat-Puffer, pH 7.5, nachgewaschen. Durch dreistündige Inkubation von 1,5 ml 0.1 M Na-Phosphat- Puffer, pH 7.5, in dem 0.2 mg CD4 gelöst sind, werden Polymerpartikel gewonnen, die zur Bindung des HIV (human immu- nodeficiency virus) herangezogen werden können. Durch induktive Erwärmung des Virus-Magnetpartikel-Komplexes (4,8 kW, 0,5 MHz) werden innerhalb von 10 Minuten Temperaturen (>60 °C) erreicht, die die Viren abtöten können.

Claims

Patentansprüche
1. Thermosensitive und biokompatible, magnetische und/oder metallische Kolloide enthaltende Polymerteilchen, die mit Hilfe eines hochfrequenten magnetischen Wechselfeldes aufheizbar sind und dadurch eine Änderung ihrer physikalischen Polymerstruktur erfahren, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Polymerteilchen verwendeten Polymere ausgewählt sind aus der Gruppe der biokompatiblen Polymere, die Polyortho- ester, Polyalkylcyanacrylate, Polyglycolsäure, Poly- etherester, Polycarbonate, Polyhydroxyalkanoate, Polyhy- droxysäuren, Poly(ε-caprolacton) , Polyaminsosäuren, Po- lysaccharide, Polysaccharid- (Meth)acrylatderivate, Liposome, Isopropylcellulose, Hydroxyalkylσellulosen, Cellu- loseacetatbutyrat. Stärke, Stärkealkylether, Collagen, Alginat, Chitosan, Polyvinylalkohol, Gelatine, ionisch vernetzte multifunktioneile Amine oder lineare Copolyme- re, Pfropfcopolymere oder Blockcopolymere dieser Polymere oder aus den Polymeren gebildete Dendrimere enthält.
2. Thermosensitive und biokompatible Polymerteilchen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymere aus einem oder mehreren Copoly er(en) oder Blockcopoly- mer(en) bestehen.
3. Thermosensitive und biokompatible, magnetische und/oder metallische Kolloide enthaltende Polymerteilσhen, gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Änderung der physikalischen Struktur in einem Quellungs-, Entquellungs-, Lösungs- oder Gelierungsprozess oder in einer Änderung der geometrischen Form der Polymeren besteht .
4. Thermosensitive und biokompatible Polymerteilchen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um sphärische nano- oder mikropartikuläre Teilchen oder Fasern, Röhren oder Fäden handelt.
5. Thermosensitive und biokompatible Polymerteilchen gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Änderung der geometrischen Form in einer Rückkehr zu einer Ursprungsform besteht, die die Polymeren vor einer wärmebedingten Formänderung innehatte („shape-memory- polymer") .
6. Thermosensitive und biokompatible Polymerteilchen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die magnetischen Kolloide ferromagnetische, superparamagnetische oder ferrimagnetische Teilchen oder Ferrite oder ein Ferrofluid mit einer Teilchengröße <1 μm und einer Curie-Temperatur im Bereich von 30 °C bis 100 °C sind.
7. Thermosensitive und biokompatible Polymerteilchen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die metallischen Kolloide aus Elementen der Gruppe 8, 9, 10 oder 11 (Gruppeneinteilung: neuer Vorschlag IUPAC 1986) bestehen.
8. Thermosensitive und biokompatible Polymerteilchen gemäß Ansprüchen 1, 6 und 7, dadurch gekennzeichnet, dass die magnetischen und/oder metallischen Kolloide mit mindestens einer oberflächenaktiven Substanz stabilisiert sind, die ein Agglomerieren der Kolloide verhindern.
9. Thermosensitive und biokompatible Polymerteilchen gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die oberflächenaktive(n) Substanz (en) Alkyl- und/oder Arylgruppen- tragende Sulfonsäure-, Sulfonat- oder Carboxylat- Derivate oder Polyethylenglycolderivate sind.
10. Thermosensitive und biokompatible Polymerteilchen gemäß einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymeren mit einem polyfunktionellen Vernetzer ausgewählt aus der Gruppe, die die Dihalogenide, Diisoσyanate, Diisothiocyanate, Dioxirane, Dialdehyde, Divinyl-Derivate enthält, vernetzt sind.
11. Thermosensitive und biokompatible Polymerteilchen gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Vernetzer eine Konzentration von 0,05 bis 10 Mol %, bezogen auf das Polymere, aufweist.
12. Thermosensitive und biokompatible Polymerteilchen gemäß einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymeren mit Biomolekülen koppelnde, reaktive Gruppen aufweisen.
13. Thermosensitive und biokompatible Polymerteilchen gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die koppelnden Gruppen mit Peptiden, Proteinen, Antikörpern, Antigenen, Enzymen, Zellrezeptor-Antikörpern, Antikörpern gegen Tumormarker, Antikörperfragmenten, künstlich hergestellten Antikörpern, abgewandelten Antikörpern, Antikörperkonjugaten, Oligosaσchariden, Glykoproteinen, Lektinen, Nukleinsäuren, Streptavidin oder Biotin umgesetzt sind.
14. Thermosensitive und biokompatible Polymerteilchen gemäß einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in den Polymeren Wirksubstanzen oder Pharmaka eingekapselt sind.
15. Thermosensitive und biokompatible Polymerteilchen gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die eingekapselten Wirksubstanzen oder Pharmaka aus der Gruppe Hormone, Zytostatika, Antikörper, Antikörperderivate, Antikörperfragmente, Cytokine, Immunmodulatoren, Antigene, Proteine, Peptide, Lektine, Glykoproteine, Nukleinsäuren, Antisens-Nukleinsäuren, Oligosaccharide, Antibiotika oder Generika ausgewählt sind.
16. Verfahren zur Herstellung thermosensitiver und biokompatibler, mittels magnetischer Induktion aufheizbarer Polymerteilchen gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche.
17. Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymeren mittels ringöffnender Polymerisation, Polykondensation, radikalischer Polymerisation oder ionischer Vernetzung hergestellt werden.
18. Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die lösliche Polymerphase in einer nicht mit der Polymerphase mischbaren organischen Phase unter Rühren dispergiert und mittels der Suspensionspräzipitation, des Suspensions -Vernetzungs-, des Aussalz-Emulsionsoder des Solvent-Evaporationsverfahrens zu mikro- oder nanopartikulären Teilchen verfestigt wird.
19. Verfahren gemäß Ansprüchen 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die magnetischen und/oder metallischen Kolloide der löslichen Polymerphase zugegeben werden und diese nach der Verfestigung des Polymeren in kolloiddisperser Form in der Polymermatrix vorliegen.
20. Verfahren gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass als magnetische Kolloide ferromagnetische-, super- paramagnetische- oder ferrimagnetische Substanzen oder Ferrite oder Ferrofluide mit einer Teilchengröße <1 μm verwendet werden.
21. Verfahren gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des zugesetzten magnetischen und/oder metallischen Kolloids 5 bis 40 Gew.-%, bezogen auf die Polymerphase, beträgt.
22. Verfahren gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass als organische Phase Mineralöle oder Pflanzenöle mit einer Viskosität von 40 bis 400 cp, organische, nicht mit Wasser mischbare Lösungsmittel oder Polyethy- lenglykole verwendet werden.
23. Verfahren gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass in der organischen Phase 0,1 bis lOVol^δ einer oder mehrerer oberflächenaktive (n) Substanz (en) gelöst wird/werden, die aus der Gruppe der Alkylsulfosuccinate, Polyoxyethylenarylether, Polyoxyethylene, Polyoxyethy- lensorbitanester, Polyoxyethylenaddukte, Polyethylenpro- pylenoxid- Blockcopolymere, Alkylphenoxypolyethoxyetha- nole, Fettalkoholpolyethylenglykolether, Polyglycerin- ester, Polyoxyethylenalkohole, Polyoxyethylensorbitan- Fettsäurester, Polyoxyethylensäuren oder Mischungen derselben ausgewählt sind.
24. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass an die Polymeren Peptide, Proteine, Antikörper, Antigene, Enzyme, Zellrezeptor-Antikörper, Antikörper gegen Tumormarker, Antikörper gegen Tumorantigene, Antikörperfragmente, künstlich hergestellte Antikörper, abgewandelte Antikörper, Antikörperkonjugate, Oligosaσcharide, Glykoproteine, Lektine, Nukleinsäuren, Streptavidin oder Biotin gekoppelt werden.
25. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass in die Polymerteilchen Wirksubstanzen oder Pharmaka eingekapselt werden.
26. Verfahren gemäß Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass als Wirksubstanz Hormone, Zytostatika, Antikörper, Cytokine, Immunmodulatoren, Antigene, Proteine, Peptide, Lektine, Glykoproteine, Nukleinsäuren, Antisense- Nukleinsäuren, Oligosaccharide, Antibiotika oder Generika verwendet werden.
27. Verwendung der thermosensitiven und biokompatiblen Polymerteilchen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15 als kontrastverstärkende Mittel in der NMR-Diagnostik, als Träger für Wirksubstanzen in der medizinisc-hen Therapie und Diagnostik, als steuerbare Träger für Reaktanden, als Mittel zur Steuerung von mikrofluiden Prozessen, als Separationsmedium in der Säulenchromatograpliie, als Mittel zur Einstellung und Regulierung von Porengrößen in Membranen, als Mittel zur Blockierung von Blutgefäßen in der Tumorbehandlung, als künstliche Zellträger, als Separationsmedium für Nukleinsäuren, Zellen, Proteinen, Steroiden, Viren oder Bakterien.
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