ARZNEIMITTEL ENTHALTEND THYMIAN UND PRIMEL ODER THYMIAN UND EFEU ALS
PDE-4-HEMMER
Beschreibung Die Erfindung betrifft einen Extrakt aus Thymian (Thymus L.) in Kombination mit Primel (Primula veris) oder Efeu (Hedera helix) zur Verwendung als PDE-4-Inhibitor in der Prophylaxe und Behandlung von ausgewählten Erkrankungen und ein
entsprechendes Arzneimittel und dessen Verwendung. Bronchipret® (eingetragene Marke der BIONORICA SE) ist ein bereits bekanntes hochpotentes Arzneimittel - ein
Phytopharmakon, welches Thymian in Kombination mit Primel oder Efeu enthält. Bronchipret® wird vorzugsweise in Form von (Film¬ tabletten (Thymian/Primel - Trockenextrakt) und Saft
(Thymian/Efeu) vertrieben. Die Herstellung des Arzneimittels ist bekannt. Die sekretolytische, bronchospasmolytische, hustenreizstillende, antiphlogistische, antibakterielle und antivirale Wirkung ist beschrieben. Ferner ist aus
WO2011/147992 der Anmelderin die Eignung von Bronchipret® zur Behandlung von COPD und Bronchitis beschrieben.
Weiterhin beschreibt R. van den Hoeven (R. van den Hoeven et al, Study of the effect of the lung function of five Austrian saddle horses suffering recurrent airways obstruction
(heaves), The Veterinary Record (2003), 152, 555-557) den Einfluss von Bronchipret® auf die Lungenfunktion beim Pferd.
Ferner beschreibt z.B. Irwin Ziment, dass Bronchipret®
besonders wirksam zur Behandlung von Bronchitis ist (Irwin Ziment, Complementary and alternative medicine therapies for chronic obstructive pulmonary disease Focus Altern Complement Ther 2003; 8 : 385-91) .
Die Eignung von Bronchipret zur Behandlung der akuten Bronchitis ist beschrieben in:
Kemmerich B, Eberhardt R, Stammer H. Efficacy and tolerability of a fluid extract combination of thyme herb and ivy leaves and matched placebo in adults suffering from acute bronchitis with productive cough. A prospective, double-blind, placebo- controlled clinical trial. Arzneimittelforschung (Drug
Research) 2006; 56 ( 9 ): 652-660 ; Kemmerich B: Evaluation of efficacy and tolerability of a fixed combination of dry extracts of thyme herb and primrose root in adults suffering from acute bronchitis with productive cough. A prospective, double-blind, placebo-controlled multicenter clinical trial. Arzneimittelforschung (Drug Research) 2007; 57 ( 9 ) : 607-615 ; Marzian 0. Treatment of acute bronchitis in children and adolescents. Non-interventional postmarketing surveillance study confirms the benefit and safety of a syrup made of extracts from thyme and ivy leaves [Article in German] MMW Fortschr Med. 2007 ; 149 ( 11 ) : 69-74 ; Ismail C, Willer G, Steindl H: Bronchipret in cases of acute bronchitis. Schweizerische Zeitschrift für Ganzheitsmedizin. 2003; 15: 171-5.
Es besteht jedoch ein hohes Bedürfnis neue wirksame
Arzneimittel zur Behandlung und Prophylaxe von weiteren
Erkrankungen der Atemwege und Lunge als auch
Autoimmunerkrankungen bereitzustellen . Überraschender Weise zeigt Bronchipret®, insbesondere eine pharmazeutische Zusammensetzung bestehend aus Thymian und Efeu oder Thymian und Primel einen inhibitorischen Effekt auf das Targetenzym „PDE-4" in der Lunge eines Säugetieres,
insbesondere eines Menschen (Uzunov, P. and Weiss, B.:
Separation of multiple molecular forms of cyclic adenosine 3 ' , 5 ' -monophosphate Phosphodiesterase in rat cerebellum by Polyacrylamide gel electrophoresis . Biochim. Biophys. Acta 284:220-226, 1972). Daher ist Bronchipret® als
Phosphodiesterase-4-Inhibitor („PDE-4-Hemmer" ) geeignet.
Es gibt 11 verschiedene Phosphodiesterase-Typen (PDE1 bis PDE11) . Von den PDE4-Subtypen sind 4 bekannt (PDE4A bis
PDE4D) . Phosphodiesterase-4-Inhibitoren (auch
Phosphodiesterase-IV-Hemmer ) sind Substanzen, die spezifisch das Enzym Phosphodiesterase IV hemmen. Die Phosphodiesterase IV bewirkt eine Umwandlung und Abbau des antientzündlich wirkenden Botenstoffs cAMP (cyklisches Adenosinmonophosphat ) in AMP . Dadurch dominieren die ent zündungsfordernden Stoffe. PDE-4-Inhibitoren erhöhen jedoch vorteilhaft die Konzentration von intrazellulärem cAMP . Zyklisches AMP (cAMP) spielt eine wichtige Rolle bei der Bewältigung von Entzündungsreaktionen. Eine verlängerte Lebenszeit von cAMP vermittelt durch PDE-4 Inhibitoren bewirkt eine anti-inflammatorische Wirkung.
Ein seit 1979 bisher nicht zugelassenes Arzneimittel als
Archetyp eines Phosphodiesterase-4-Inhibitors ist der
Wirkstoff Rolipram, welcher zur Behandlung von Depression und Multipler Sklerose entwickelt wurde. PDE-4-Inhibitoren wirken jedenfalls entzündungshemmend und wurden u.a. in den
Anwendungsgebieten COPD, Asthma bronchiale, Depression und Multiple Sklerose untersucht. Spezifische Inhibitoren der Isoform 4 (PDE4) werden z.B. bei der Behandlung von COPD eingesetzt (z.B. Daxas®) . Bislang wurde lediglich ein Wirkstoff als Arzneimittel zugelassen und zwar Roflumilast (Daxas®) für die Behandlung von COPD. Die Entwicklung von Cipamfyllin und
anderer PDE4-Inhibitoren wurden eingestellt, jedoch Weitere befinden sich in der Entwicklung (z.B. Apremilast).
Daher erweist Bronchipret® einen curativen und palliativen Effekt zur Prophylaxe und Behandlung von Erkrankungen der Atemwege und Lunge als auch Autoimmunerkrankungen ausgewählt aus der Gruppe der durch PDE-4-Inhibitoren verbundenen
Erkrankungen .
Die Erfindung betrifft daher ein Arzneimittel enthaltend
Thymian und Efeu oder Thymian und Primel, insbesondere eines Extraktes aus Thymian und Efeu oder Thymian und Primel, zur
Verwendung oder Anwendung in der Prophylaxe und Behandlung von Erkrankungen der Atemwege und Lunge als auch
Autoimmunerkrankungen ausgewählt aus der Gruppe der durch PDE- 4-Inhibitoren verbundenen Erkrankungen und zwar: Atemwege und Lunge:
Asthma-Formenkreis ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus atopischem Asthma, nicht-atopischem Asthma, allergischem
Asthma, atopischem IgE-vermitteltem Bronchialasthma,
Bronchialasthma, essentiellem Asthma, intrinsischem Asthma, verursacht durch pathophysiologische Störungen, extrinsischem Asthma, verursacht durch Umweltfaktoren, essentiellem Asthma aus unbekannter oder nicht-offensichtlicher Ursache,
bronchitischem Asthma, emphysematösem Asthma, Belastungs- induziertem Asthma, Allergen-induziertem Asthma, allergisches Asthma, Asthma, das durch kalte Luft induziert wird,
berufsbedingtem Asthma, Infektionsasthma, das durch Bakterien- , Pilz-, Protozoen- oder Virusinfektion verursacht wird, nichtallergischem Asthma, beginnendem Asthma,
Kurzatmigkeitssyndrom bzw. Keuchen bei Säuglingen bzw.
Kleinkindern ("wheezy infant Syndrome") ,
Bronchiolitis, chronischer oder akuter Bronchokonstriktion, Obstruktion der kleinen Luftwege und Emphysem; obstruktiver oder entzündlicher Luftwegeerkrankungen eines beliebigen Typs, einer beliebigen Ätiologie oder Pathogenese, insbesondere eine obstruktive oder entzündliche Luftwegeerkrankung, die ein Mitglied ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus
chronischer eosinophiler Pneumonie, Schocklunge (ARDS),
Exazerbation einer Hyperreaktivität der Luftwege als Folge einer anderen Wirkstofftherapie und Luftwegeerkrankung, die mit pulmonalem Hochdruck assoziiert ist,
Bronchitis-Formenkreis ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus akuter laryngotrachealer Bronchitis, durch Erdnüsse
ausgelöster Bronchitis ("arachidic bronchitis " ) , Bronchitis, catarrhalis, Kruppbronchitis, trockener Bronchitis,
infektiöser asthmatischer Bronchitis, produktiver Bronchitis, Staphylococcus- oder Streptokokken-Bronchitis und
Bläschenbronchitis , akuter Lungenverletzung, Emphysem, posttraumatischer
Lungeninsuffizienz , postinfektiösen Husten (auch: subakuter Husten),
Bronchiektasie eines beliebigen Typs, einer beliebigen
Ätiologie oder Pathogenese, insbesondere Bronchiektasie- Formenkreis ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus
zylinderförmiger Bronchiektasie, sackförmigen Bronchiektasen, fusiformer Bronchiektasie, Bronchiolektasie ("capillary bronchiectasis " ) , cystischer Bronchiektasie, trockener
Bronchiektasie und follikulären Bronchiektasen,
Autoimmunerkrankungen :
Autoimmunerkrankungen der Lunge und Haut ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus systemischer Lupus erythematodes,
Polyarteritis nodosa, Goodpasture-Syndrom, Sklerodermie,
Wegenersche Granulomatose, S ögren-Syndrom, Hamman-Rich- Syndrom, Sarkoidose, Dermatitis, Dermatitis herpetiformis Duhring, atopische Dermatitis, Psoriasis, Dermatomyositis .
Im Rahmen dieser Erfindung bezeichnet Erkrankungen der
Atemwege und Lunge oder Autoimmunerkrankungen ausgewählt aus der Gruppe der durch PDE-4-Inhibitoren verbundenen
Erkrankungen, solche Erkrankungen wie vorstehend ausgeführt. Die genannten Indikationen samt ihren Ursachen und Ätiologie können z.B. Mutschier, E. et al . , Arzneimittelwirkungen, 8. Aufl., wiss. Verl. Ges. mbH, Stuttgart, 2001 oder Pschyrembel®, de Gruyter, Berlin, 2012 entnommen werden. Zudem sind die besagten Indikationen in der ICD-10-WHO Version 2013,
Internationale statistische Klassifikation der Krankheiten und verwandter Gesundheitsprobleme, 10. Revision Version 2013 (online) erfasst. Die vorgenannte Indikation „postinfektiöser Husten" überdauert zeitlich den auslösenden bronchialen Infekt um mehrere Wochen. Nach manchem akutem Virusinfekt kann es acht Wochen dauern, bis der postinfektiöse Husten spontan abklingt (Kardos P et al . Leitlinie der Deutschen Gesellschaft für Pneumologie und Beatmungsmedizin zur Diagnostik und
Therapie, Pneumologie 2010; 64: 336-373). Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung oder Anwendung von Thymian und Efeu oder Thymian und Primel oder ein
jeweiliger Extrakt davon zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe und Behandlung von Erkrankungen der Atemwege und Lunge als auch Autoimmunerkrankungen ausgewählt aus der Gruppe der PDE-4 verbundenen Erkrankungen.
Weiterhin ist erfindungsgemäß vorteilhaft, dass Thymian und Efeu oder Thymian und Primel oder ein jeweiliger Extrakt davon eine Steigerung der Mukoziliäre Clearance erlauben. Die
Mukoziliäre Clearance ist ein Mechanismus, bei dem sowohl Fremdpartikel als auch Schleim aus Bronchien und Luftröhre nach oben abtransportiert werden. Hierzu sind die
Epithelzellen mit Zilien besetzt, die rhythmisch schlagen und den Schleim fortbewegen. Eine eingeschränkte Schlagfrequenz (CBF) führt zum Erlahmen des Abtransports und wird durch
Husten kompensiert. Ein Antrieb der Schlagfrequenz kann daher Husten beseitigen und die mucusvermittelte Obstruktion der Atemwege verringern. Überraschender Weise zeigen Thymian und Efeu oder Thymian und Primel oder ein jeweiliger Extrakt davon eine vorteilhafte Induktion der ziliären Schlagfrequenz, so dass der curative und palliative Effekt der durch PDE-4-
Inhibitoren verbundenen Erkrankungen positiv unterstützt wird.
Darüber hinaus zeigen Thymian und Efeu oder Thymian und Primel oder ein jeweiliger Extrakt davon, einen vorteilhaften
sekundären Effekt zum Inflammationsschut z , wie in Beispiel 4 und Figur 4 belegt, welcher begleitend zur PDE-4-Inhibition erfolgt und eine unterstützende Rationale für die vorgenannten und erfindungsgemäßen Indikationen begründet.
Die genannten erfindungsgemäßen Pflanzen (drogen) für das erfindungsgemäße Arzneimittel können wie üblich für die jeweilige Pflanzendroge aus bevorzugten Pflanzenteilen
gewonnen werden, wie Blatt, Wurzel, etc., wie einschlägig beschrieben (siehe z.B. Ph.Eur., Europäisches Arzneibuch). Insbesondere können wässrige und/oder ethanolische Extrakte verwendet werden oder daraus erhältliche Trockenextrakte. Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Extrakte wird auf die
technischen Lehren, die Gegenstand von EP 1368605B1, EP
0753306B1 sind, verwiesen.
In vorteilhafter und an sich bekannter Weise können die
Arzneimittel der vorliegenden Erfindung hergestellt werden und können in Form einer ihrer Anwendung entsprechenden
galenischen Formulierung eingesetzt werden.
Die galenischen Formulierungen der erfindungsgemäßen
Arzneimittel sind dadurch gekennzeichnet, dass sie orale
Formulierungen wie Dragees, Tabletten, Filmtabletten, Pulver, Kapseln oder flüssige Verdünnungen, insbesondere Tropfen, Säfte oder Sirupe umfassen.
Bei Einsatz zur topischen Applikation oder Verwendung eignen sich insbesondere Sprays, Salben, Emulsionen, Puder, Pulver, flüssige oder feste Präparate für die Inhalation, Kompressen, Tamponaden, Tonsillenpinsellösungen oder Gurgellösungen.
Ferner betrifft die Erfindung eine pharmazeutische
Formulierung enthaltend ein erfindungsgemäßes Arzneimittel. Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können in Form von
pharmazeutischen Zubereitungen oder Zusammensetzungen in
Dosierungseinheiten zubereitet werden. Dies bedeutet, dass die Zubereitung oder Zusammensetzung in Form einzelner Teile, z.B. Tabletten, Dragees, Kapseln, Pillen, Suppositorien und
Ampullen vorliegen, deren Wirkstoffgehalt einem Bruchteil oder einem Vielfachen einer Einzeldosis entsprechen. Die
Dosierungseinheiten können z.B. 1, 2, 3 oder 4 Einzeldosen oder 1/2, 1/3 oder 1/4 einer Einzeldosis enthalten. Eine
Einzeldosis enthält vorzugsweise die Menge Wirkstoff, die bei einer Applikation verabreicht wird und die gewöhnlich einer ganzen, einer halben, einem Drittel oder einem Viertel einer Tagesdosis entspricht.
Unter nicht-toxischen, inerten pharmazeutisch geeigneten
Trägerstoffen sind feste, halbfeste oder flüssige
Verdünnungsmittel, Füllstoffe und Formulierungshilfsmittel jeder Art zu verstehen.
Der Begriff Arzneimittel umfasst ebenfalls Mittel gleicher Eignung, wie z.B. Nahrungsergänzungsmittel oder gar
Lebensmittel, sofern die vorteilhafte erfindungsgemäße Wirkung des Mittels verwirklicht ist.
Als bevorzugte pharmazeutische Formulierungen seien Tabletten, Dragees, Kapseln, Pillen, Granulate, Suppositorien, Lösungen, Saft, Suspensionen und Emulsionen, Pasten, Salben, Gele,
Cremes, Lotions, Puder und (Nasen) Sprays genannt. Tabletten, Dragees, Kapseln, Pillen und Granulate können den oder die
Wirkstoffe neben den üblichen Trägerstoffen enthalten, wie a) Füll- und Streckmittel, z.B. Stärken, Milchzucker, Rohrzucker, Glukose, Mannit und Kieselsäure, b) Bindemittel, z.B.
Carboxymethylcellulose, Alginate, Gelatine,
Polyvinylpyrrolidon, c) Feuchthaltemittel, z.B. Glycerin, d) Sprengmittel, z.B. Agar-Agar, Calciumcarbonat und
Natriumcarbonat , e) Lösungsverzögerer , z.B. Paraffin und f) Resorptionsbeschleuniger, z.B. quartäre Ammoniumverbindungen, g) Netzmittel, z.B. Cetylalkohol , Glycerinmonostearat , h) Adsorptionsmittel, z.B. Kaolin und Bentonit und i)
Gleitmittel, z.B. Talkum, Calcium- und Magnesiumstearat und feste Polyethylenglykole oder Gemische der unter a) bis i) aufgeführten Stoffe. Die Tabletten, Dragees, Kapseln, Pillen und Granulate können mit den üblichen, gegebenenfalls Opakisierungsmittel
enthaltenden Überzügen und Hüllen versehen sein und auch so zusammengesetzt sein, daß sie den oder die Wirkstoffe nur oder bevorzugt in einem bestimmten Teil des Intestinaltraktes gegebenenfalls verzögert abgeben, wobei als Einbettungsmassen z.B. Polymersubstanzen und Wachse verwendet werden können.
Der oder die Wirkstoffe können gegebenenfalls mit einem oder mehreren der oben angegebenen Trägerstoffe auch in
mikroverkapselter Form vorliegen. Suppositorien können neben dem oder den Wirkstoffen die üblichen wasserlöslichen oder wasserunlöslichen Trägerstoffe enthalten, z.B. Polyethylenglykole, Fette, z.B. Kakaofett und höhere Ester (z.B. C14-Alkohol mit C16-Fettsäure) oder
Gemische dieser Stoffe.
Salben, Pasten, Cremes und Gele können neben dem oder den Wirkstoffen die üblichen Trägerstoffe enthalten, z.B.
tierische und pflanzliche Fette, Wachse, Paraffine, Stärke, Tragant- Cellulosederivate, Polyethylenglykole, Silikone, Bentonite, Kieselsäure, Talkum und Zinkoxid oder Gemische dieser Stoffe.
Puder und Sprays können neben dem oder den Wirkstoffen die üblichen Trägerstoffe enthalten, z.B. Milchzucker, Talkum, Kieselsäure, Aluminiumhydroxid, Calciumsilikat und
Polyamidpulver oder Gemische dieser Stoffe. Sprays können zusätzlich die üblichen Treibmittel enthalten.
Lösungen und Emulsionen können neben dem oder den Wirkstoffen die üblichen Trägerstoffe wie Lösungsmittel, Lösungsvermittler und Emulgatoren, z.B. Wasser, Ethylalkohol , Isopropylalkohol, Ethylcarbonat , Ethylacetat, Benzylalkohol , Benzylbenzoat , Propylenglykol , 1,3- Butylenglykol , Dimethylformamid, Öle, insbesondere Baumwollsaatöl , Erdnußöl, Maiskeimöl, Olivenöl, Ricinusöl und Sesamöl, Glycerin, Glycerinformal ,
Tetrahydrofurfurylalkohol , Polyethylenglykole und
Fettsäureester des Sorbitans oder Gemische dieser Stoffe enthalten .
Suspensionen können neben dem oder den Wirkstoffen die
üblichen Trägerstoffe wie flüssige Verdünnungsmittel, z.B.
Wasser, Ethylalkohol, Propylenglykol, Suspendiermittel, z.B.
ethoxylierte Isostearylalkohole, Polyoxyethylensorbit- und Sorbitan-Ester , mikrokristalline Cellulose,
Aluminiummetahydroxid, Bentonit, Agar-Agar und Tragant oder Gemische dieser Stoffe enthalten. Die genannten
Formulierungsformen können auch Färbemittel,
Konservierungsstoffe sowie geruchs- und geschmacksverbessernde Zusätze, z.B. Pfefferminzöl und Eukalyptusöl und Süßmittel, z.B. Saccharin, enthalten.
Weitere Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung ergeben sich aufgrund der Beschreibung von
Ausführungsbeispielen. Die nachfolgenden Beispiele und Figuren dienen zur Erläuterung der Erfindung ohne die Erfindung auf diese Beispiele zu beschränken.
1. Hemmung der Phosphodiesterase-4-Aktivität In einem in vitro Standard-Experiment konnte gezeigt werden, dass die Mischung aus Thymian- und Primel-Trockenextrakt
(„BRO-TP") in der Lage ist, konzentrationsabhängig die
Aktivität der katalytischen Domäne der PDE4 Enzyme zu hemmen Die IC50 lag dabei bei 21 - 26 pg/mL. Ebenfalls die
Einzelextrakte hemmten die Aktivität der katalytischen Domäne (Thymian: ca. 20 pg/mL; Primel: 10 - 12 pg/mL) . In weiteren Experimenten wurde die spezifische Wirkung auf die PDE4- Subtypen PDE4B und PDE4D untersucht. Auch hier konnte für alle Extrakte inhibitorische Aktivität gezeigt werden: Bei PDE4B2 lagen die IC50-Werte von BRO-TP, Thymian und Primel bei 26, 22 und 51 pg/mL, für PDE4D3 bei 17, 11 und 28 pg/mL (siehe Figur 1) ·
Methodik: Die katalytische Domäne (PDE4Cat) und die Enzymsubtypen PDE4B2 und -D3 wurden mit 6 Konzentrationen von BRO-TP inkubiert (3,07 - 300 pg/mL) und die katalytische
Aktivität in einem radiometrischen Assay bestimmt. Als
Positivkontrolle diente der Wirkstoff Rolipram (supra).
2. Induktion der ziliären Schlagfrequenz (CBF)
In einem ex vivo Experiment wurden dünne Lungenschnitte
(Precision-Cut Lung Slices - PCLS) mit der Thymian/Primel Extraktmischung und den Einzelextrakten behandelt und die Schlagfrequenz der epitheliären Zilien analysiert. Die
Behandlung mit BRO-TP (supra) führte ab 100 pg/mL zu einer deutlichen Steigerung der CBF gegenüber Thymian oder Primel alleine (siehe Figur 2) .
Methodik: Aus Meerschweinchenlungen wurden 300 pm dicke PCLS gewonnen und in 24-Well-Platten mit Medium überführt. Zum Medium wurden aufsteigende Konzentrationen der Extrakte gegeben (10pg/mL, 32pg/mL, 100pg/mL, 320pg/mL, and 1000pg/mL) und die Schlagfrequenz am Ziliensaum der Atemwege
videomikroskopisch analysiert. Zum Vergleich wurde der
Einfluss des Vehikels (0,005 - 0,5 % Ethanol) bestimmt. Die maximale Frequenzsteigerung wurde durch Zugabe von Methacholin bestimmt (10 μΜ) .
Es konnte gezeigt werden, dass die anti-inflammatorische
Wirkung der Thymian/Primel Trockenextraktmischung u.a. über eine Hemmung der PDE4 Enzymaktivität vermittelt wird. Außerdem geht von Thymianextrakt eine ex vivo zilienschlagstimulierende Wirkung aus, die auch durch die Extraktmischung hervorgerufen
werden kann. Die Ergebnisse wurden in Modellen erhoben, die relevant für die Pathogenese und Therapie der beanspruchten Indikationen sind und liefern damit hinreichend Beweis, dass insbesondere die Kombination von Thymian- und Primel- (Trocken) Extrakt , wie sie in Bronchipret® enthalten ist, auch bei der Behandlung von Patienten wirksam sind.
3. BRO-TP - TNFalpha-Freiset zung in vitro (Antiinflammation)
Modell: TNFalpha (Tumornekrosefaktor alpha) -Freiset zung aus LPS (Lipopolysaccharid) -stimulierten Immunzellen Protokoll - LPS ( Dexamethasone ) : Humane PBMC in 96 Well
Platten in Kulturmedium (RPMI 1640, 10% FBS, 1% Pen/Strep, 2 mM L-Alanyl-L-glutamin) , Zelldichte: 5E4 Zellen/Well (cytokine plate) , 2E5 Zellen/Well (alamarBlue plate) . Inkubieren der Zellen für 1 h bei 37°C in 5% CO2, Zugabe der Komponenten und Dexamethasone (vehicle Kontrolle = 0.15% EtOH) , Inkubieren der Platten für 1 h bei 37°C in 5% CO2, anschließend Zugabe von LPS und Inkubieren der Platten für 24 h bei 37°C in 5% CO2,
Zentrifugieren (1.000 rpm, 10 Min.), Sammeln der Überstände und Einfrieren bei - 80 °C. Die Proben wurden ausgewertet und die Daten sind in Figur 3 dargestellt .
Fazit: BRO-TP hemmt die Freisetzung des pro-inflammatorischen Zytokins TNFa aus LPS-stimulierten humanen Immunzellen
4. Leukotriene-Bildung und 5-LO Aktivität
Frisch isolierte humane Neutrophilen (5 x 106 Zellen/ml für LTB4 Bildung) oder Monozyten (1 x 106 Zellen/ml für cys-LT Bildung) in PGC Puffer wurden für 10 min bei 37°C (mit Vehicle (0.025% EtOH) ) inkubiert, THY/PRI , THY, PRI (0,4-100 pg/mL jeweils) oder Zileuton (3 μΜ) und anschließend für 10 min bei 37°C mit Ionophor A23187 (2,5 μΜ) stimuliert. Die Reaktion wurde mit Eis gestoppt und geeignete Reagenzien für LTB4 Analyse oder für cys-LT Analyse hinzugefügt. LTB4 wurde mit HPLC analysiert. Cys-LTs wurde mit ELISA analysiert. Die
Ergebnisse sind in Figur 4 dargestellt.
5-LO wurde in transformierten E. coli B121 exprimiert und mit ATP Affinitätschromatographie aufgereinigt . Zur Bestimmung der 5-LO Aktivität wurden Enzyme in einer Reaktionsmischung zu 5- LO hinzugefügt. Proben wurden inkubiert für 10 min bei 4°C (mit vehicle (0,25% EtOH)), THY/PRI, THY, PRI (0,4-100 μg/ml jeweils), oder Zileuton (3 μΜ) , vorgewärmt bei 37°C, und CaCl2 and Arachidonsäure (20 μΜ) wurden hinzugefügt. Die Reaktion wurde nach 10 min bei 37°C abgebrochen und Prostaglandin Bl (interner Standard) wurde hinzugegeben. Erhaltene Metaboliten wurden mit HPLC analysiert und zwar 5-LO Produkte inkl. LTB4 all-trans Isomere und 5-H(P)ETE. Die Ergebnisse sind in Figur 4 dargestellt.
Fazit: BRO-TP zeigt verbesserte anti-entzündliche Effekte (5- LO) gegenüber Thymian und Primel alleine.