DE3424640C2 - - Google Patents

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Description

Die Erfindung betrifft das im Anspruch 1 angegebene Verfahren zur Bestimmung und/oder Gewinnung von humanspezifischem Interferon (im folgenden mit "HuIFN" bezeichnet) aus Humangesamtblut. Die Ansprüche 2 bis 10 betreffen Ausgestaltungen dieses Verfahrens.
In den letzten Jahren sind klinische Versuche, bei denen der Spiegel eines Blutenzyms oder dessen Metabolits chemisch bestimmt werden, vielfach verwendet worden.
Da HuIFN, ein Blutbestandteil, Antivirus- und Antitumoraktivitäten zeigt, wurde vorgeschlagen, den Spiegel des Serum-HuIFN in die Spezifikationen des klinischen Tests aufzunehmen. Dieser Vorschlag konnte jedoch nicht durchgeführt werden, da die Menge an Serum-HuIFN sehr gering ist.
Aus einem Artikel von J. Hilfenhaus in Chemie in unserer Zeit, Nr. 3, 1981, Seiten 71 bis 77, geht hervor, daß normalerweise durch eine Zelle (Blut besteht aus Plasma, in dem die Blutkörperchen suspendiert sind) kein Interferon synthetisiert wird. Es bedarf einer exogenen Stimulation, wobei beispielsweise eine solche Stimulation eine Virusinfektion ist (vgl. insbesondere Seite 75, rechte Spalte, Zeile 1 bis 9).
Blut besteht aus einer Flüssigkeit, dem Plasma, in dem Blutkörperchen suspendiert sind, wie Erythrocyten, Leukocyten und Plättchen. Ein mm³ Blut enthält im allgemeinen zusätzlich zu 7,4×10³ Leukocyten und 3×10⁵ Plättchen beim Erwachsenen 5,4×10⁶ Erythrocyten beim Mann oder 4,8×10⁶ bei der Frau.
Es ist wohl bekannt, daß HuIFN durch Humanleukocyten gebildet wird.
In herkömmlichen Verfahren zur Gewinnung von HuIFN werden abgetrennte lebensfähige Leukocyten aus Humanblut verwendet. So werden zum Beispiel wie bei Hans Strander und Karl Cantell, Ann. Med. exp. Fenn., Bd. 44, Seiten 265-273 (1966) (insbesondere S. 265, rechte Spalte "Materials and methods" bis S. 266, Abs. 4 und S. 269-270) und den JA-PS 6 111/74 und 94 008/78 beschrieben Leukocyten von anderen vorhandenen Blutkörperchen im Gesamtblut abgetrennt und zur Bildung von HuIFN verwendet.
Eingehende Untersuchungen dieser herkömmlichen Verfahren bestätigen, daß nur eine geringe Leukocytenausbeute aus Blut möglich ist, d. h. 30 bis 50%, daß Leukocyten während der Trennung beschädigt werden, daß die Lebensfähigkeit auf 40 bis 60% und ggf. die Gesamtausbeute auf 10 bis 30% sinkt; außerdem ist die HuIFN-Bildung in den abgetrennten Leukocyten unbeständig; diese Tatsachen machen die Bestimmung der HuIFN-Bildung von Blut sehr schwierig und sind ein Hindernis für die HuIFN-Gewinnung in größeren Mengen (siehe auch H. Strander und K. Cantell, aaO., Seite 267, linke Spalte im Abschnitt "Incubation of the leucocytes in vitro").
Erfindungsgemäß wird nun ein Verfahren zur Bestimmung und/oder Gewinnung von humanspezifischem Interferon (HuIFN) aus Humangesamtblut zur Verfügung gestellt, wobei man das im Blut angereicherte HuIFN in bekannter Weise bestimmt und/oder isoliert, dadurch gekennzeichnet, daß man vor der Bestimmung und/oder Gewinnung des HuIFN Humangesamtblut in einem Gefäß mit wirkungsvollen Mengen eines Antikoagulanz und eines Virus versetzt und unter solchen Bedingungen inkubiert, daß sich eine wesentliche Menge an HuIFN anreichert.
Dadurch lassen sich größere Mengen HuIFN aus dem kostbaren Humanblut gewinnen, und es läßt sich die Bildung von HuIFN unter Verwendung von Spenderblut bestimmen. Außerdem wurde festgestellt, daß die HuIFN-Bildung von Gesamtblut leicht und mit hoher Reproduzierbarkeit bestimmt werden kann, wenn man Gesamtblut in einem Gefäß mit einem Antikoagulanz und einem Virus versetzt und inkubiert und das angereicherte HuIFN titriert.
Eingehende Versuche bestätigen, daß das Zusetzen eines intakten oder inaktivierten Virus in einer Menge von 20 bis 200 000 HA/ml Gesamtblut günstig ist. "HA" bedeutet die Einheit des Hämagglutinationstiters eines Virus.
Der Ausdruck "Gesamtblut" bedeutet Frischblut-Präparate von Spendern sowie Suspensionen, die dadurch erhalten wurden, daß man von solchen Blutpräparaten das Plasma entfernt und die zurückbleibenden Blutkörperchen in einer geeigneten Nichtplasmaflüssigkeit suspendiert, z. B. physiologische Kochsalzlösung, Pufferlösung oder Kulturnährmedium.
Jedes Antikoagulanz, das die Koagulation von Gesamtblut verhindert und die HuIFN-Bildung nicht beeinträchtigt, kann im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden; so sind z. B. Heparin, Säure-Zitrat-Dextrose (ACD) oder Zitronensäure- Dextrose (ACD) und Zitrat-Phosphat-Dextrose (CPD) günstig.
Viren, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, sind solche, die die HuIFN-Bildung in Gesamtblut induzieren können. So können z. B. Sendai-Virus oder Newcastle-Disease- Virus intakt oder nach Inaktivierung verwendet werden. Bei inaktivierten Viren ist die Reproduzierbarkeit z. B. teilweise oder vollständig unterdrückt z. B. durch UV-Bestrahlung, Erhitzen oder Behandeln bei einem extremen pH-Wert. Für die Beimpfung mit dem Virus ist eine Menge von 20 bis 200 000 HA/ml Gesamtblut geeignet.
Die Inkubation des Gesamtbluts in einem Gefäß bei gleichzeitiger Behandlung des Gesamtbluts mit dem Antikoagulanz und dem Virus wird so durchgeführt, daß das Gesamtblut in dem Gefäß mit dem Antikoagulanz und dem Virus zur Bildung von HuIFN behandelt wird. Zum Beispiel können die vorgeschriebenen Mengen an Antikoagulanz und Virus in dem Gefäß mit einer entsprechenden Menge an Gesamtblut versetzt werden; das Gemisch wird darin inkubiert. Andererseits kann man ein Gemisch von Antikoagulanz und Gesamtblut in einem Gefäß mit dem Virus versetzen und inkubieren. Bei dieser Inkubation kann man ein geeignetes Medium zusätzlich verwenden, z. B. physiologische Kochsalzlösung, isotone Pufferlösung oder ein Kulturnährmedium.
Behälter, Gefäße, Flaschen, Proberöhrchen, Ampullen und Mikroplattenvertiefungen jeder Form und jeden Volumens können als Gefäß im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.
Die Inkubationsbedingungen, bei denen HuIFN gebildet wird, sind z. B. ein Temperaturbereich von 30 bis 40°C und eine Inkubationszeit von 5 bis 50 h. In diesem Fall kann, wenn notwendig, Induktion oder Superinduktion durchgeführt werden.
Nach der Inkubation zur Bildung von HuIFN und einer eventuellen Verdünnung mit physiologischer Kochsalz- oder isotoner Pufferlösung wird das Gesamtblut in einem (geeigneten) Verfahren getrennt, wie Zentrifugieren oder Filtrieren, um die Blutkörperchen, wie Blutzellen, zu entfernen; der entstandene Überstand oder das Filtrat, die HuIFN enthalten, werden gereinigt oder titriert.
Um ein HuIFN-Präparat mit einer höchstmöglichen Reinheit zu erhalten, kann das HuIFN durch Kombination herkömmlicher Verfahren gereinigt werden, z. B. durch Aussalzen, Dialyse, Filtrieren, Einengen, Adsorption und Desorption an einem Ionenaustauscher, Gelfiltration, Affinitätschromatographie unter Verwendung eines geeigneten Liganden, wie eines Antikörpers, Fraktionieren am isoelektrischen Punkt und Elektrophorese.
Das erhaltene HuIFN kann günstigerweise als Injektion oder Arzneimittel für äußere und interne Verwendung konfektioniert und zur Vorbeugung und Behandlung von Humanerkrankungen allein oder in Kombination mit einer oder mehreren Substanzen verwendet werden.
Die HuIFN-Bildung in Humangesamtblut kann erfindungsgemäß dadurch bestimmt werden, daß man den HuIFN-Spiegel in dem oben beschriebenen Überstand oder Filtrat titriert. Zu diesem Zweck kann jede Bestimmungsmethode verwendet werden, vorausgesetzt, die HuIFN-Bildung durch Gesamtblut wird durch die Titration erfaßt, z. B. biochemische Analysen (Bioassay), Radioimmunoassay und enzymgebundene Immunoadsorptionsversuche.
In den letzten Jahren sind enzymgebundene Immunoadsorptionsversuche zur sehr sicheren, geeigneten und rasch durchzuführenden Bestimmungsverfahren entwickelt worden. Jeder enzymgebundene Immunoadsorptionsversuch, mit dem man IFN als Antigen titrieren kann, kann im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Zum Beispiel sind die doppelte bzw. Doppel-Antikörper- Sandwich-Technik und die modifizierte Doppel-Antikörper- Sandwich-Technik günstig.
Es wurde bestätigt, daß die auf diese Weise bestimmte Bildung von HuIFN für die klinische Untersuchung der einzelnen Spender sehr geeignet ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren bestätigt, daß das von einem Krebspatienten gesammelte Blut eine viel geringere HuIFN- Bildung aufweist als das Blut von gesunden freiwilligen Spendern.
Die folgenden Versuche erläutern die Erfindung.
Versuch 1 Wirkung einer Vorbehandlung auf HuIFN-Bildung in Blut
Die Wirkung einer Vorbehandlung von Blut auf die HuIFN-Bildung wurde untersucht. In diesem Versuch werden frische Blutproben von drei gesunden freiwilligen Spendern nach der Behandlung mit Heparin verwendet.
Die in diesem Versuch verwendeten behandelten Blutproben waren wie folgt:
eine plasmafreie Suspension, erhalten durch Zentrifugieren von Blut zur Entfernung des Plasmas und Suspendieren der zurückbleibenden Blutkörperchen in RPMI 1640-Medium in der gleichen Blutkörperchendichte wie im Blut;
eine mit Ammoniumchlorid behandelte Suspension, erhalten durch Behandeln von Blut mit Tris-HCl-Puffer (pH 7,2), der 0,75% Ammoniumchlorid enthält, in herkömmlicher Weise, um die Hämolyse der Erythrocyten zu bewirken, Zentrifugieren des Gemisches und Suspendieren der zurückbleibenden erythrocytenfreien Blutkörperchen in RPMI 1640-Medium in der gleichen Blutkörperchendichte wie im Blut.
1-ml-Proben des heparinisierten oder behandelten Bluts werden in verschiedene Kunststoffproberöhrchen eingefüllt und mit 0,1 ml physiologischer Kochsalzlösung versetzt, die Sendai-Virus in Mengen von 0, 100 bzw. 1000 HA enthält, und dann 16 h bei 37°C inkubiert. Die inkubierten Gemische werden mit UV bestrahlt, um den Sendai-Virus vollständig zu inaktivieren, und zentrifugiert; in den erhaltenen Überständen werden die HuIFN-Titer je ml Gesamtblut bestimmt. Der HuIFN-Titer wird durch die Farbstoffaufnahme gemäß Anne L. R. Pidot, Applied Microbiology, Bd. 22, Nr. 4, Seiten 671 bis 677 (1971), bestimmt. Der Hämagglutationstiter (HA) wird gemäß J. E. Salk, The Journal of Immunology, Bd. 49, Seiten 87-98 (1944), mit einer geringfügigen Änderung bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben.
Wie aus diesen Ergebnissen ersichtlich ist, sind Gesamtblut und plasmafreie Suspensionen, die die gesamten Blutkörperchen enthalten, für die Bestimmung der HuIFN-Bildung günstig, da sie HuIFN in hoher Ausbeute und Beständigkeit bilden. Die Ergebnisse bestätigen auch, daß die mit Ammoniumchlorid behandelte Suspension, in der die Erythrocyten hämolysiert und entfernt worden sind, eine niedrige und unbeständige HuIFN-Bildung geben.
Tabelle 1
Versuch 2 Wirkung einer Virusimpfung auf die HuIFN-Bildung
Die Wirkung einer Virusimpfung auf die HuIFN-Bildung wird untersucht. Frische Blutproben von drei gesunden freiwilligen Spendern und zwei Krebspatienten werden nach der Behandlung mit Heparin verwendet.
Gemäß Versuch 1 wird 1 ml jeder heparinisierten Blutprobe in verschiedene Proberöhrchen eingefüllt, mit 0,1 ml physiologischer Kochsalzlösung versetzt, die Sendai-Virus in Mengen von 0, 2, 20, 200, 2000, 20 000 bzw. 200 000 HA enthält, inkubiert; der HuIFN-Titer je ml Blut wird bestimmt.
Eine Versuchsreihe mit 2 000 000 HA Sendai-Virus je ml Blut war geplant, wurde jedoch nicht durchgeführt, da Präparate mit einem so hohen Sendai-Virus-Titer nicht herstellbar waren.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben.
Tabelle 2
Wie aus diesen Ergebnissen ersichtlich ist, sind Virusbeimpfungen im Bereich von 20 bis 200 000 HA/ml Blut günstig.
Die Ergebnisse bestätigen, daß das Blut von einem Krebspatienten viel weniger HuIFN bildet als das Blut von gesunden freiwilligen Spendern. Das läßt vermuten, daß die Bestimmung der HuIFN-Bildung im Blut für den Nachweis von Krebs im frühen Stadium hilfreich sein könnte.
Verschiedene Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden nachstehend erläutert.
Bildung von HuIFN Beispiel 1
Ein ml heparinisiertes frisches Blut eines gesunden freiwilligen Spenders wird in ein Kunststoffproberöhrchen eingefüllt, mit 1000 HA Sendai-Virus versetzt, bei 37°C 20 h inkubiert und mit UV bestrahlt, um den Virus vollständig zu inaktivieren. Nach dem Zentrifugieren des Gemisches wird der HuIFN-Titer des Überstandes bestimmt.
Die HuIFN-Bildung beträgt etwa 3600 Einheiten je ml Blut.
Beispiel 2
Ein ml einer heparinisierten Frischblutprobe eines gesunden freiwilligen Spenders wird mit 2000 HA Newcastle-Desease- Virus versetzt, dessen Reproduzierbarkeit zu 90% inaktiviert worden ist. Nach der 15stündigen Inkubation bei 37°C wird der HuIFN-Titer des Gemisches gemäß Beispiel 1 bestimmt.
Die HuIFN-Bildung beträgt etwa 2800 Einheiten je ml Blut.
Beispiel 3
Eine heparinisierte Frischblutprobe von gesunden freiwilligen Spendern wird zur Entfernung des Plasmas zentifugiert. Die so erhaltenen Blutkörperchen werden in der Zentrifuge mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und in RPMI 1640-Medium zu der gleichen Blutkörperchendichte wie im Blut suspendiert.
Die entstandene Suspension wird in ein Minigefäß eingefüllt und mit 500 HA Sendai-Virus je ml Suspension versetzt. Nach der 16stündigen Inkubation bei 37°C wird das Gemisch behandelt und dessen HuIFN-Titer gemäß Beispiel 1 bestimmt.
Die HuIFN-Bildung beträgt etwa 3000 Einheiten je ml Blut.
Beispiel 4
Eine Blutkörperchen enthaltende Suspension wird gemäß Beispiel 3 hergestellt.
Die Suspension wird in ein Minigefäß eingefüllt, mit 300 Einheiten HuIFN je ml Suspension versetzt und 6 h bei 37°C inkubiert. Dann wird die Suspension mit 1000 HA Sendai- Virus je ml Suspension versetzt und weitere 16 h bei 37°C inkubiert. Das entstandene Gemisch wird gemäß Beispiel 1 behandelt und auf HuIFN untersucht.
Die HuIFN-Bildung beträgt etwa 27 000 Einheiten je ml Blut.
Bestimmung der HuIFN-Bildung im Blut Beispiel 5
1 ml heparinisiertes Frischblut eines gesunden freiwilligen Spenders, eines 28jährigen Mannes, wird gemäß Beispiel 1 behandelt und biochemisch auf den HuIFN-Titer untersucht.
Die HuIFN-Bildung beträgt etwa 3600 Einheiten je ml Blut.
Beispiel 6
1 ml einer heparinisierten Frischblutprobe eines gesunden freiwilligen Spenders, einer 33jährigen Frau, wird gemäß Beispiel 2 behandelt und dessen HuIFN-Titer gemäß Beispiel 5 bestimmt.
Die HuIFN-Bildung beträgt etwa 2800 Einheiten je ml Blut.
Beispiel 7
Eine heparinisierte Frischblutprobe eines gesunden freiwilligen Spenders, eines 61jährigen Mannes, wird gemäß Beispiel 3 behandelt; man erhält eine Blutkörperchen enthaltende Suspension.
1 ml der Suspension wird in ein Kunststoffproberöhrchen eingefüllt und mit 1000 HA Sendai-Virus versetzt. Nach der 16stündigen Inkubation bei 37°C wird das Gemisch zur Bestimmung des HuIFN-Titers der doppelten Antikörper- Sandwich-Technik unterworfen, das ist ein enzymgebundener Immunoadsorptionsversuch.
Die HuIFN-Bildung beträgt etwa 3400 Einheiten je ml Blut. Dieser Wert entspricht dem, der durch biochemische Analyse (bioassay) erhalten wurde.
Beispiel 8
Eine heparinisierte Frischblutprobe eines Krebspatienten, eines 68jährigen Mannes, wird gemäß Beispiel 5 behandelt; man erhält eine HuIFN-Bildung von etwa 140 Einheiten je ml Blut.
Beispiel 9
Eine heparinisierte Frischblutprobe einer Krebspatientin, einer 55jährigen Frau, wird gemäß Beispiel 5 behandelt; man erhält eine HuIFN-Bildung von etwa 70 Einheiten je ml Blut.
Für den Fachmann ist ersichtlich, daß verschiedene Änderungen durchgeführt werden können, ohne den Schutzumfang der Erfindung zu überschreiten, und daß die Erfindung nicht auf die Beschreibung beschränkt ist.

Claims (10)

1. Verfahren zur Bestimmung und/oder Gewinnung von humanspezifischem Interferon (HuIFN) aus Humangesamtblut, wobei man das im Blut angereicherte HuIFN bestimmt und/oder isoliert, dadurch gekennzeichnet, daß man vor der Bestimmung und/oder Gewinnung des HuIFN Humangesamtblut in einem Gefäß mit wirkungsvollen Mengen eines Antikoagulanz und eines Virus versetzt und unter solchen Bedingungen inkubiert, daß sich eine wesentliche Menge an HuIFN anreichert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge des Virus im Bereich von 20 bis 200 000 Hämagglutinationstiter je ml Gesamtblut liegt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Antikoagulanz mindestens eine Verbindung aus der aus Heparin, Säure-Zitrat-Dextrose und Zitrat-Phosphat-Dextrose bestehenden Gruppe ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Virus aus der aus Sendai-Virus und Newcastle-Disease-Virus bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Humangesamtblut bei einer Temperatur im Bereich von 30 bis 40°C 5 bis 50 h lang inkubiert wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man Humangesamtblut verwendet, das durch
  • - Entfernen des Plasma aus einem Spenderblut und
  • - Suspendieren der zurückbleibenden Blutkörperchen in einer Lösung aus der aus physiologischer Kochsalzlösung, isotoner Pufferlösung oder einem Kulturnährmedium bestehenden Gruppe erhalten worden ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, zur Bestimmung der HuIFN-Bildung in Humangesamtblut zur Früherkennung von Krebs.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das angereicherte HuIFN mittels Bioassay titriert wird.
9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das angereicherte HuIFN mittels Radioimmunoassay titriert wird.
10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das angereicherte HuIFN mittels Enzym-Immunoassay titriert wird.
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