DE10055886A1 - Impfstoffe, die rekombinante Hantavirusproteine enthalten, Verfahren zu iher Herstellung und ihre Verwendung - Google Patents

Impfstoffe, die rekombinante Hantavirusproteine enthalten, Verfahren zu iher Herstellung und ihre Verwendung

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Abstract

Die Erfindung betrifft Impfstoffe gegen Hantaviren, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung. Das Anwendungsgebiet ist die Medizin bzw. die Veterinärmedizin. Die Erfindung besteht in der Verwendung eines Hefe-Hochexpressionssystems, das die Gewinnung großer Mengen rekombinanter Hantavirus-Proteine erlaubt. Die rekombinanten Proteine werden durch Dichtegradientenzentrifugation oder Affinitätschromatografie gereinigt. Durch die Gewinnung der Proteine aus Hefezellen sind diese Endotoxin-frei und für humane Anwendungen als Impfstoffe sowie in der Diagnostikaentwicklung geeignet.

Description

Die Erfindung betrifft Impfstoffe gegen Hantaviren, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung. Anwendungsgebiete sind die Medizin bzw. Veterinärmedizin. Die Erfindung soll die hocheffiziente Produktion von nicht-infektiösen, Endotoxin-freien rekombinanten Hantavirus-Proteinen ermöglichen, die für eine humane Anwendung als Impfstoff geeignet sind.
Hantaviren werden wegen ihrer zunehmenden Bedeutung als Krankheitserreger zu den "emerging viruses" gezählt. Sie sind als Erreger des in Europa und Asien auftretenden Hämorrhagischen Fiebers mit Renalem Syndrom, HFRS, (Schmaljohn et al., 1985, Science 227, 1041-1044) und des in Amerika Anfang der 90er Jahre neu aufgetretenen, mit hoher Letalität einhergehenden Hantaviralen Pulmonalen Syndroms, HPS (Nichol et al., 1993, Science 262, 914-917), identifiziert worden. Das als HFRS (Abkürzungsverzeichnis hinter den Ausführungsbeispielen) zusammengefasste Krankheitsbild wird von unterschiedlichen Serotypen hervorgerufen: Den schwersten Krankheitsverlauf verursachen Infektionen mit den Serotypen Hantaan (HTNV) und Dobrava (DOBV), während Infektionen mit den Serotypen Seoul (SEOV) und Puumala (PUUV) mildere klinische Verläufe zeigen. Insgesamt treten weltweit etwa 200000 HFRS-Fälle pro Jahr auf (Krüger und Zöller, 1996, in: Virusdiagnostik, Porstmann, T., Hrg., Blackwell Wissenschaftsverlag, Berlin Wien Oxford, S. 117-128.). In Europa konnte die Ko-Existenz der humanpathogenen Serotypen DOBV und PUUV gezeigt werden (Sibold et al., 1999, Am. J. Trop. Med. Hyg. 61, 409-411; Sibold et al., 2001, J. Med. Virol., im Druck).
Hantaviren bilden einen separaten Genus innerhalb der Familie Bunyaviridae (Schmaljohn et al., 1995, Arch. Virol. Suppl. 10, 300-315). Das RNA-Genom negativer Polarität setzt sich aus 3 Segmenten zusammen, die die virale RNA-Polymerase, die Glykoproteine G1 und G2 sowie das Nukleokapsidprotein (N) kodieren.
Wegen der endemischen Verbreitung von Hantaviren in Asien wurden in China, Süd- und Nordkorea sowie in Japan verschiedene inaktivierte Hantavirus-Vakzinen hergestellt und erprobt (Übersicht in Schmaljohn, 1994, Rev. Med. Virol. 4, 185-196). Bisher ist lediglich ein HTNV-Totimpfstoff (Handelsname: Hantavax) in Korea für die humane Anwendung zugelassen worden (Cho and Howard, 1999, Vaccine 17, 2569-2575). Obwohl mit den bisher entwickelten Vollvirus-Totvakzinen z. T. hoffnungsvolle Impferfolge erzielt werden konnten, bleiben eine Reihe von offenen Problemen bestehen: Wegen des hohen Gefährdungspotentials der Hantaviren muss ihre Vermehrung unter L3-Laborbedingungen erfolgen. Die Virusausbeute bei Kultivierung in Zellkulturen ist sehr gering. Die bei den bisher getesteten Vakzinen beobachtete geringe Virus-neutralisierende Aktivität wird möglicherweise durch den nur geringen Anteil von G1 und G2 am Gesamtprotein sowie die Zerstörung der G1- und G2-Konformation bei der Virusinaktivierung verursacht.
Eine Lösungsmöglichkeit für die genannten Probleme ist die Herstellung von rekombinanten Virus-Untereinheiten-Vakzinen. In Tierexperimenten konnte durch Immunisierung mit Vaccinia Virus (VACV)-abgeleiteten Vakzinen, die die kompletten M-Segmente von HTNV bzw. SEOV trugen, eine schützende Immunantwort gegen das entsprechende homologe Virus (Schmaljohn et al., 1990, J. Virol. 64, 3162-3170; Xu et al., 1992, Am. J. Trop. Med. Hyg. 47, 397-404) induziert werden. Während bei Immunisierung mit HTNV- und SEOV-VACV- Rekombinanten auch gegen SEOV und HTNV geschützt wurde, wurde gegen einen PUUV- Challenge nicht geschützt (Chu et al., 1995, J. Virol. 69, 6417-6423).
Eine rekombinante HTNV-VACV-Vakzine zeigte in einer klinischen Phase I-Studie die Immunogenität und Sicherheit der Vakzine. Eine Phase II-Studie zeigte bei Immunisierung zwar bei ¾ von VACV-naiven Probanden die Induktion von Virus-neutralisierenden Antikörpern, jedoch nur etwa bei ¼ der VACV-immunen Probanden (McClain et al., 2000, J. Med. Virol. 60, 77-85).
Die bisher hergestellten nackten DNA-Vakzinen auf der Basis von G1/G2-kodierenden Konstrukten zeigten in Tiermodellen die Induktion virus-neutralisierender Antikörper und Protektion an (Hooper et al., 1999, Virology 255, 269-278; Bharadwaj et al., 1999, Vaccine 17, 2836-2843; Kamrud et al., 1999, Virology 263, 209-219). Dagegen konnte bei Inokulation von N-kodierenden Konstrukten keine bzw. nur eine schwache Protektion induziert werden. Für eine klinische Anwendung von DNA-Vakzinen sind jedoch noch eine Reihe von Fragen bezüglich der Sicherheit (Gefahr der Toleranzinduktion, Integration der DNA, Autoimmunität) zu untersuchen (Davis and Cluskie, 1999, Microbes and Infection 1, 7-21). Alternativ wurden Sindbisvirus-abgeleitete Konstrukte getestet, die jedoch eine deutlich geringere Protektion als DNA-Vakzine-Konstrukte zeigten (Kamrud et al., 1999).
Gegenüber den bisher genannten Systemen bieten rekombinante Proteine bezüglich der Sicherheit deutliche Vorteile (keine Infektiosität, keine Integration). In einer Reihe von heterologen Expressionssystemen, wie E. coli und Insektenzellen, konnten rekombinante Hantavirus-Proteine hergestellt werden, die in Tiermodellen eine protektive Immunantwort induzierten (Schmaljohn et al., 1990, J. Virol. 64, 3162-3170; Yoshimatsu et al., 1993, Arch. Virol. 130, 365-376; Lundkvist et al., 1996, Virology 216, 397-406; Ulrich et al., 1998, Vaccine 16, 272-280). Während E. coli-Expressionssysteme eine Hochexpression von Hantavirus-Proteinen erlauben, stellt eine mögliche Kontamination mit bakteriellen Endotoxinen ein Problem für die humane Anwendung dar. Demgegenüber bieten Insektenzell-Expressionssysteme den Vorteil, frei von Endotoxinen zu sein, sind jedoch in ihrer Syntheseleistung für Fremdproteine den E. coli-Systemen unterlegen.
Die Geschichte der Entdeckung und der Bekämpfung von Hantaviren lässt sich auch anhand der Patentliteratur dokumentieren. C. S. Schmaljohn und J. Dalrymple hatten zunächst 1987 und dann 1991 zusammen mit D. J. McClain in den USA Patentanmeldungen hinterlegt, die sich auf Hantavirus-Proteine bzw. auf Vakzine beziehen, insbesondere auf die Glykoproteine G1 und G2: US-PS (PS = Patentschrift)5298423 und 5614193. 1993 ließen sich S. T. Nichol, C. F. Spiropoulou, T. G. Ksiazek und P. E. Rollin den Nachweis des Hantavirus "Four Corners Virus" schützen (US 5945277, WO 9500648), 1995 aus dieser Gruppe P. E. Rollin, L. Elliot, T. G. Ksiazek und S. T. Nichol den Nachweis des "Black Creek Canal Hantavirus" (US 5853980). In Korea meldeten 1996 H. S. Kim, W. D. Yoo, S. O. Kim, K. S. Noh und S. P. Hong "Hantaan virus nucleocapsid protein expressed from E. coli" (WO 9727302) zum Patent an, im gleichen Jahr in Schweden (SE) Å. Lundkvist einen Impfstoff gegen Hantavirus oder Puumalavirus auf der Basis des Nukleokapsid-Proteins (N) (WO 9728819). In den USA folgten 1997 B. L. Hjelle und N. Torrez-Martinez mit einer Nukleokapsidprotein-Vakzine des "Rio Mamore Hantavirus" (WO 9901153), 1998 in Korea H. W. Lee, S. J. Ryu, C. N. Ahn, H. Kim und T. Tomiyama mit einer Anmeldung des Titels "Diagnostic reagent for Puumala virus infection" (EP 952450). Auf das Jahr 1999 gehen die USA-Anmeldungen von S. T. Nichol, S. Morzunov, T. G. Ksiazek und P. E. Rollin über die Entdeckung und Isolierung des neuen Hantavirus "Bayou" (US 5916754) sowie von C. S. Schmaljohn und J. W. Hooper über eine DNA-Vakzine gegen Hantavirus-Infektionen (WO 2000044406) zurück. Die aufgezeigten Lösungen lassen jedoch die bereits oben erwähnten Probleme von rekombinanten Proteinen aus E. coli, von DNA-Vakzinen und VACV-abgeleiteten Lebendvakzinen offen.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Hantavirus-Impfstoffe zu entwickeln, die für humane Anwendungen unbedenklich sind. Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, dass mit Hilfe eines Hefe-Expressionssystems, das die Hochexpression von Hantavirus-Proteinen erlaubt, rekombinante Hantavirus-Proteine in großer Menge aus Hefezellen isoliert und durch einfache Zentrifugationsschritte und/oder durch Affinitätschromatografie gereinigt werden. Die erfindungsgemäß gewonnenen Proteine haben sich als Endotoxin-frei und für humane Anwendungen unbedenklich erwiesen.
Die Erfindung hat die PCR-Amplifkation und Klonierung von Hantavirusprotein­ kodierenden Sequenzen zum Inhalt. Diese DNA-Sequenzen werden in Hefeexpressionsvektoren mit einer Hefe-spezifischen Expressionseinheit (Promoter und Transkriptionsstopsignal) eingebaut. Die Expression der Hantavirusproteine erfolgt in Hefezellen, bevorzugt in Saccharomyces cerevisiae Stamm fh4c (ATCC #42368; Colona und Lampen, 1974, Biochemistry 13, 2741-2748). Nach Aufschluss der Hefezellen mit Hilfe von Glasperlen werden die authentischen Hantavirusproteine durch zwei aufeinanderfolgende Cäsiumchlorid-Dichtezentrifugationen, Hexahistidin-tragende Hantavirusproteine durch Anreicherung des unlöslichen Proteins und anschließende Nickelchelatchromatografie gereinigt. Die anschließende Analyse der rekombinanten Proteine erfolgt durch SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese und anschließende Silberfärbung des Gels bzw. Immunoblot mit Hantavirus-spezifischen Antikörpern. Die Protektivität der Proteine wird durch Immunisierung von Rötelmäusen, dem natürlichen Wirt des PUUV, und anschließende PUUV-Belastung (Challenge) erbracht. Der Schutz wird anhand von fehlenden anti-G2- Antikörpern im Serum, fehlenden N-Antigens in der Lunge und fehlenden RNA-Nachweises mittels S-Segment-spezifischer PCR erbracht.
Durch die Erfindung wird ein neuartiges Expressionssystem für Hantavirusproteine verfügbar, das gegenüber den bisherigen Systemen in E. coli bzw. Insektenzellen wesentliche Vorteile aufweist. So erlauben Hefe-Expressionssysteme eine einfache und kostengünstige biotechnologische Produktion von Antigenen. Des weiteren besitzen Hefen keine Toxine, die unerwünschte Nebenwirkungen bei humanmedizinischen Anwendungen hervorrufen würden. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass Hefesysteme bereits für die humane Vakzineproduktion zugelassen sind: Die rekombinante HBV-Vakzine basiert auf Hefe­ exprimiertem HBsAg.
Es ist besonders überraschend, dass die Hefezellen die Hantavirusproteine in großer Menge synthetisieren. Außerdem können die rekombinanten Proteine nach der Lyse der Hefezellen in großer Menge mit einfachen Methoden isoliert und gereinigt werden. Durch die Art der Gewinnung aus Hefezellen sind die erfindungsgemäßen Proteine Endotoxin-frei und für humane Anwendungen als Impfstoffe sowie in der Diagnostikaentwicklung geeignet.
Das Wesen der Erfindung besteht in der Bereitstellung von Hantavirus-Impfstoffen, die als wirksame Komponenten rekombinante Hantavirusproteine enthalten, wobei die Proteine ihrerseits in Hefezellen hergestellt werden. Als wirksame Komponenten enthalten sie Nukleokapsidproteine und/oder Glykoproteine von Hantaviren, wie der Hantavirus-Serotypen Puumala, Dobrava und/oder Hantaan, insbesondere der Hantavirus-Stämme Puumala- Vranica/Hällnäs, Dobrava-Slovakia und/oder Hantaan-Fojnica. Als Hefezellen finden Saccharomyces cerevisiae Verwendung, insbesondere des Stammes fh4c.
Ein besonderes Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass ein Hefeexpressionsplasmid eingesetzt wird, das einen Hefe-spezifischen GAL10-PYK1-Hybrid- Promoter und das FDH1-Gen von Candida maltosa als dominanten Selektionsmarker trägt. Die Hefezellen werden in YEPD-Medium (1% Hefe-Extrakt, 2% Pepton, 2% Glukose) mit 5 mM Formaldehyd angezüchtet, danach wird durch Zugabe von Galaktose (Endkonzentration 3%) die Synthese der Hantavirusproteine induziert. Der Aufschluss der Hefezellen erfolgt durch Glasperlen.
Die rekombinanten Hantavirusproteine werden durch zwei aufeinanderfolgende Cäsiumchlorid-Dichtegradienten-Zentrifugationen oder durch Anreicherung der unlöslichen Proteine und anschließende Nickelchelat-Affinitätschromatografie gereinigt.
Die erfindungsgemäßen Verwendungen der rekombinanten Hantavirusproteine liegen in ihrem Einsatz als wirksame Komponenten in Hantavirus-Impfstoffen sowie in der Diagnostikaentwicklung basierend auf dem ELISA- und/oder Immunoblot-Prinzip.
Die Merkmale der Erfindung gehen außer aus den Ansprüchen auch aus der Beschreibung hervor, wobei die einzelnen Merkmale jeweils für sich allein oder zu mehreren in Form von Kombinationen vorteilhafte schutzfähige Ausführungen darstellen, für die mit dieser Schrift Schutz beantragt wird. Die Kombination besteht aus bekannten (Hantavirusproteinen, Zentrifugation, Affinitätschromatografie) und neuen Elementen (ein neuartiges Expressionssystem für Hantavirusproteine), die sich gegenseitig beeinflussen und in ihrer neuen Gesamtwirkung einen Gebrauchsvorteil und den erstrebten Erfolg ergeben, der darin liegt, dass nunmehr rekombinante Hantavirus-Proteine in großer Menge aus Hefezellen isoliert, durch einfache Arbeitsschritte (Zentrifugation, Chromatografie) gereinigt und dem Anwender zur Verfügung gestellt werden können.
Die Erfindung soll nachfolgend durch ein Ausführungsbeispiel näher erläutert werden, ohne auf dieses Beispiel beschränkt zu sein.
Ausführungsbeispiel 1. Gewinnung der Hantavirus-kodierenden Sequenzen
Die kompletten offenen Leserahmen für PUUV- (Stamm Vranica/Hällnäs; Reip et al., 1995, Arch. Virol. 140, 2011-2026), DOBV- (Slowakischer Stamm 862; Sibold et al., 2001, J. Med. Virol., im Druck) und HTNV- (Stamm Fojnica; Sibold et al., 1999, Am. J. Trop. Med. Hyg. 61, 409-411) N-Proteine werden nach Standardverfahren PCR-amplifiziert unter Verwendung der nachfolgend genannten Primer, die einen XbaI-Restriktionsort tragen:
PUUV (Vranica/Hällnäs; Fig. 1)
Forward primer
Reverse primer
DOBV (Slovakia 862; Fig. 2)
Forward primer
Reverse primer
HTNV (Fojnica; Fig. 3)
Forward primer
Reverse primer
Die erhaltenen PCR-Produkte werden in die Klonierungsvektoren pUC57 (Fermentas, Vilnius, Litauen), pCRII (Invitrogen, Groningen, Niederlande) bzw. pCR-Blunt II-TOPO (Invitrogen) inseriert. Durch DNA-Sequenzierung werden die Nukleotidsequenzen der Hantavirus-Inserts der Plasmide pUC57-Vranica N, pCRII-Slovakia N und pCR-Blunt II- TOPO-Fojnica N verifiziert (Fig. 1-3).
Um 6 Histidin-Kodonen mit dem 5'-Ende der N-Protein-kodierenden Sequenzen zu fusionieren, werden die Hantavirus-Sequenzen in den Plasmiden pUC57-Vranica N, pCRII- Slovakia N und pCR-Blunt II-TOPO-Fojnica N mit folgenden Primern PCR-amplifiziert (Fig. 1-3):
His-PUUV (Vranica/Hällnäs; Fig. 1)
Forward primer
Reverse primer
His-DOBV (Slovakia 862; Fig. 2)
Forward primer
Reverse primer
His-HTNV (Fojnica; Fig. 3)
Forward primer
Reverse primer
Die His-PUUV- und His-DOBV-PCR-Amplifikate werden in den pCR-Blunt II-TOPO- Vektor, das His-HTNV-Amplifikat in den Vektor pUC57 inseriert. Die komplette kodierende Sequenz von pCR-Blunt II-TOPO-His-Vranica N wird durch DNA-Sequenzierung verifiziert. Bei den beiden anderen Plasmiden werden nur die kodierenden Sequenzen für die N-Termini der N-Proteine bestimmt, und die C-Terminus-kodierenden Teile werden durch entsprechende Fragmente aus den Plasmiden pCRII-Slovakia N und pCR-Blunt II-TOPO-Fojnica N ersetzt (Fig. 1 bis 3).
Fig. 1 bis 3
PCR-Amplifikation und Klonierung der Hantavirus-N-Protein-kodierenden Sequenzen
Legende zu den Fig. 1 bis 3
Fig. 1
B Histidine tail generation
A Construction of yeast expression vector for non His tagged N Protein
C Construction of yeast expression vector for His tagged N Protein
Fig. 2 und 3
A Histidine tail generation
B Construction of yeast expression vector for non His tagged N Protein
C Construction of yeast expression vector for His tagged N Protein
2. Herstellung von Hefe-Expressionsvektoren
Das Hefeexpressionsplasmid, vorzugsweise pFX7 (Scherneck, Sasnauskas und Ulrich, Offenlegungsschrift DE 197 50 220 A1, PCT/DE 98/03329; Sasnauskas et al., 1999, Biol. Chem. 380, 381-386; siehe Fig. 4), enthält
einen Hefe-spezifischen GAL10-PYK1-Hybrid-Promoter,
  • - eine Transkriptionsterminationssequenz (von PGK1),
  • - ein 2 µm DNA-Fragment,
  • - das FDH1-Gen von Candida maltosa als dominanten Selektionsmarker
  • - und einen unikalen Restriktionsort für die Restriktionsendonuklease XbaI zur Insertion von Fremdsequenzen, lokalisiert zwischen Promoter und Transkriptionsterminator.
Die Hantavirus N-Protein-kodierenden Sequenzen (mit eigenem Translationsinitiations- und - terminationssignal) werden durch XbaI- bzw. SpeI-Spaltungen aus den Klonierungsvektoren isoliert und in den mit XbaI linearisierten Hefeexpressionsvektor pFX7 inseriert (in Fig. 5, Fig. 6 ist als Beispiel der Aufbau der pFX7-abgeleiteten Plasmide mit PUUV-N-kodierenden Inserts gezeigt). Rekombinante Plasmide werden nach Transformation in E. coli K12 selektioniert und durch Restriktionskartierung charakterisiert.
Fig. 4 bis 6
Aufbau der pFX7-abgeleiteten Expressionsplasmide
Fig. 4: pFX7
Fig. 5: pFX7-PUUV-N
Fig. 6: pFX7-His6-PUUV-N
3. Expression der Hantavirus-Nukleokapsidproteine in Hefe
Die pFX7-abgeleiteten Expressionsplasmide, die die authentischen und His6-getailten PUUV-, DOBV- und HTNV-N-Proteine kodieren, werden in die Hefe Saccharomyces cerevisiae, vorzugsweise in den Wildtypstamm fh4c, transformiert. Zur Anzucht der transformierten Hefezellen werden 100 ml YEPD-Medium (1% Hefe-Extrakt, 2% Pepton, 2% Glukose; mit 5 mM Formaldehyd) mit den Hefezellen beimpft und 24 Stunden bei 30°C unter Schütteln kultiviert. Die Zellkultur wird 1 : 1 mit YEPG-Induktionsmedium (1% Hefe-Extrakt, 2% Pepton, 6% Galaktose; mit 5 mM Formaldehyd) verdünnt und weitere 18 Stunden kultiviert. Die Zellen werden mit PBS gewaschen und das Zellsediment bei -20°C eingefroren. Für die Expressionskontrolle wird ein Aliquot entnommen und mit Lysepuffer (0, 125 M Tris-HCl, pH 6,8; 4% SDS, 20% Glycerin, 10% 2-Mercaptoethanol, 0,2 mg/10 ml Bromphenolblau) denaturiert. Nach Auftrennung im SDS-Polyacrylamidgel werden die rekombinanten Hantavirus-N-Proteine im Western blot unter Verwendung von N- und His6- spezifischen Antikörpern nachgewiesen (Fig. 7).
Fig. 7
Nachweis der rekombinanten Hantavirus-N-Proteine in Totallysaten von Hefezellen mittels Western blot unter Verwendung des N-spezifischen Antikörpers 1C12 (A) und eines His6- spezifischen Antikörpers (B)
1-DOBV-His-N; 2-DOBV-N; 3-HTNV-His-N; 4-HTNV-N; 5-PUUV-His-N; 6- Negativkontrolle (pFX7).
4. Aufschluss der Hefezellen und Anreicherung der Hantavirus-Nukleokapsidproteine
Die, wie unter 3. beschrieben, angezüchteten Hefezellen werden nach Sedimentation in 10 ml Lysepuffer (20 mM PBS, pH 7,6; 2 mM EDTA; 1 mM PMSF) resuspendiert und nach Zugabe eines äquivalenten Volumens von Glasperlen (Durchmesser 0,5 mm) durch Vortexing für 5 Minuten bei 4°C aufgeschlossen. Zur Sedimentierung der Zellbruchstücke werden die Lysate 5 Minuten bei 2000 xg zentrifugiert. Unlösliche Proteine werden durch Zentrifugation bei 10 000 xg für 40 Minuten (4°C) sedimentiert. Da die rekombinanten Hantavirus-N-Proteine fast ausschließlich im Sediment gefunden werden, wird der Überstand verworfen. Um die N- Proteine in der Pelletfraktion weiter anzureichern, werden kontaminierende zelluläre Proteine zwei Mal extrahiert durch Resuspendieren des Pellets in 10 ml Extraktionspuffer (20 mM PBS, pH 7,6; 2 mM EDTA; 1 mM PMSF; 1% Tween 20), Schütteln für 1 Stunde bei 4°C und Zentrifugation bei 10 000 xg für 30 Minuten (4°C). Die im Sediment befindlichen authentischen N-Proteine werden anschließend durch Cäsiumchlorid-Dichtegradienten- Zentrifugation (siehe 5.), die His6-getailten N-Derivate durch Nickelchelat-Affinitäts­ chromatografie gereinigt (siehe 6.).
5. Reinigung der authentischen Hantavirus-Nukleokapsidproteine
Das Sediment, wie unter 4. beschrieben, wird in 4 ml Extraktionspuffer resuspendiert. Zwei ml der Suspension werden auf einen vorgeformten Cäsiumchloridgradienten (Cäsiumchlorid- Dichte von 1,1, 1,2, 1,3, 1,4 und 1,5 g/ml in 20 mM PBS, pH 7,6; 2 mM EDTA, 1% Tween 20) geschichtet und 24 Stunden bei 36000 U/min bei 4°C (Beckman-Ultrazentrifuge) zentrifugiert. Gradientenfraktionen von jeweils 0,5 ml werden durch SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese und Western blot-Analyse charakterisiert. Hantavirus- Protein-enthaltende Fraktionen werden einer zweiten Cäsiumchloriddichtegradienten- Zentrifugation unterzogen. Positive Gradientenfraktionen werden gegen PBS dialysiert, aliquotiert und bei -20°C gelagert. Die Ausbeute der 3 rekombinanten Hantavirusproteine, die nach der Bradfordmethode (Bradford-Reagenz von BioRad, München, Deutschland; Bradford, 1976, Analyt. Biochem. 72, 248-254) bestimmt wurde, liegt im Durchschnitt bei etwa 1,5 mg pro g Feuchtgewicht (entspricht ca. 18 mg pro 1 Kulturvolumen).
6. Reinigung von Hexahistidin-tragenden Hantavirus-Nukleokapsidproteinen
Die sedimentierte unlösliche Proteinfraktion (siehe 4.) wird in 5 ml Qiagen-Puffer A gelöst (6 M Guanidinhydrochlorid; 0,1 M NaH2PO4; 0,01 M Tris-HCl, pH 8,0). Zwei ml Ni+-NTA- Resin, vorher äquilibriert in Puffer A, wird dazugegeben und anschließend 1 Stunde geschüttelt. Die Reinigung der N-Proteine erfolgt mit Hilfe einer Säulenchromatographie, entsprechend der Vorschrift des Herstellers für die denaturierende Reinigung von unlöslichen Proteinen (Qiagen, Hilden, Deutschland). Geringe Mengen der rekombinanten Proteine werden in Puffer D, aber der Hauptteil der N-Proteine wird in Puffer E (8 M Harnstoff; 0,1 M NaH2PO4; 0,01 M Tris-HCl, pH 4,5) eluiert. Fraktionen werden gesammelt und anschließend mittels SDS-Polyacylamid-Gelelektrophorese und Western blot analysiert. Die 3 rekombinanten Proteine wurden mit einer Ausbeute von im Durchschnitt etwa 1,25 mg pro g Feuchtgewicht (entspricht ca. 15 mg pro 1 Kulturvolumen) erhalten.
7. Schutz von Rötelmäusen gegen Hantavirus-Challenge durch Immunisierung mit authentischem, Hefeexprimiertem Puumalavirus-Nukleokapsidprotein
Entsprechend einem Standard-Protokoll (Lundkvist et al., 1996, Virology 216, 397-406; Ulrich et al., 1998, Vaccine 16, 272-280) werden Rötelmäuse, Clethrionomys glareolus, mit Nickelchelatchromatografie-gereinigtem PUUV-His-N-Protein immunisiert. Entsprechend diesem Protokoll werden 3 Immunisierungen mit jeweils 50 µg im Abstand von jeweils 3 Wochen subkutan verabreicht. Die erste Immunisierung erfolgt unter Zusatz von komplettem Freund's Adjuvanz, die zweite mit inkomplettem Freund's Adjuvanz, die dritte ohne zusätzliches Adjuvanz. Das Virus-Challenge erfolgt durch Inokulation mit 104 ID50 Einheiten des PUUV-Stammes Kazan (Lundkvist et al., 1997, J. Virol. 71, 9515-9523). Drei Wochen nach Challenge werden die Tiere bezüglich der Infektionsmarker analysiert. Das Fehlen von N-Antigen und S-Segment-spezifischer RNA in der Lunge (bestimmt mit Hilfe der PCR; Niklasson und Lundkvist, 1999, In: Manual of Hemorrhagic Fever with renal syndrome and hantavirus pulmonary syndrome; H. W. Lee, C. Calisher, C. Schmaljohn, Hrg.; WHO Collaborating Center for Virus Reference and Research, Asian Institute for Life Sciences, Seoul) sowie von G2-spezifischen Antikörpern im Serum (nach Challenge) zeigt eine vollständige sterile Protektion an, während der Nachweis einzelner Infektionsparameter auf eine partielle Protektion hinweist. Alle 4 immunisierten Tiere zeigen keinen der Infektionsmarker an, d. h. sie werden durch die Immunisierung vollständig vor dem Viruschallenge geschützt (Tab. 1). In nicht-vakzinierten Tieren werden nach Challenge alle 3 Infektionsmarker nachgewiesen; in Tieren ohne Challenge fehlen alle 3 Infektionsmarker.
Tabelle 1
Nachweis der Induktion einer protektiven Immunantwort in Rötelmäusen
Abkürzungsverzeichnis
ATCC American Type Culture Collection
DOBV Hantavirus-Serotyp Dobrava
DNA Desoxyribonukleinsäure (desoxyribonucleic acid)
E. coli Escherichia coli
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
EP Europäische Patentanmeldung
FDH1 Gen von Candida maltosa, das eine Formaldehyddehydrogenase kodiert
(vermittelt Resistenz gegen Formaldehyd)
G1 Hantavirus-Glykoprotein G1
G2 Hantavirus-Glykoprotein G2
GAL10-PYK1 Hefe-spezifischer Hybrid-Promoter
HBsAg HBV-Oberflächenantigen
HBV Hepatitis-B-Virus
HFRS Hämorrhagisches Fieber mit Renalem Syndrom
HPS Hantavirales Pulmonales Syndrom
HTNV Hantavirus-Serotyp Hantaan
ID50
Infektionsdosis (Prozentsatz)
L3 Labor der Sicherheitsstufe 3
Ni+-NTA Nickel-Nitrilotriacetic acid
PBS Phosphatpuffer (phosphate buffered sahne)
PCR Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction)
PCT Patent Cooperation Treaty
pFX7 Hefeexpressionsplasmid
PGK1 Gen von Saccharomyces cerevisiae, das eine Phosphoglyceratkinase kodiert
PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid
PS Patentschrift
PUUV Hantavirus-Serotyp Puumala
RNA Ribonucleinsäure (ribonucleic acid)
SDS Natriumdodecylsulfat (Sodium Dodecylsulfat)
SEOV Serotyp Seoul
Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
Tween 20 Tween. .®: RÖMPP CHEMIE LEXIKON, Georg Thieme Verlag Stuttgart
New York 1995, Tween 20: Polyethoxysorbitanlaurat
VACV Vaccinia Virus
WO Internationale Patentanmeldung über PCT

Claims (17)

1. Hantavirus-Impfstoffe, die als wirksame Komponenten rekombinante Hantavirusproteine enthalten, hergestellt in Hefezellen.
2. Impfstoffe nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie als wirksame Komponenten
  • 1. 2.1. Nukleokapsidproteine und/oder
  • 2. 2.2. Glykoproteine
von Hantaviren enthalten.
3. Impfstoffe nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie Nukleokapsidproteine der Hantavirus-Serotypen Puumala, Dobrava und/oder Hantaan enthalten.
4. Impfstoffe nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass sie Nukleokapsidproteine der Hantavirus-Stämme Puumala-Vranica/Hällnäs, Dobrava-Slovakia und/oder Hantaan- Fojnica enthalten.
5. Impfstoffe nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass als Hefezellen Saccharomyces cerevisiae Verwendung finden.
6. Impfstoffe nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Hefezellen Saccharomyces cerevisiae, Stamm fh4c, verwendet wird.
7. Verfahren zur Herstellung von Hantavirus-Impfstoffen der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass man als wirksame Komponenten rekombinante Hantavirusproteine einsetzt, die in Hefezellen gewonnen werden.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass als wirksame Komponenten Nukleokapsidproteine und/oder Glykoproteine
  • 1. 8.1. von Hantaviren
  • 2. 8.2. der Hantavirus-Serotypen Puumala, Dobrava und/oder Hantaan
  • 3. 8.3. der Hantavirus-Stämme Puumala-Vranica/Hällnäs, Dobrava-Slovakia und/oder Hantaan- Fojnica
eingesetzt werden.
9. Verfahren nach den Ansprüchen 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, dass als Hefezellen Saccharomyces cerevisiae, insbesondere der Stamm fh4c, eingesetzt wird.
10. Verfahren nach den Ansprüchen 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass ein Hefeexpressionsplasmid eingesetzt wird, das einen Hefe-spezifischen GAL10-PYK1-Hybrid- Promoter und das FDH1-Gen von Candida maltosa als dominanten Selektionsmarker trägt.
11. Verfahren nach den Ansprüchen 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Hefezellen in YEPD-Medium (1% Hefe-Extrakt, 2% Pepton, 2% Glukose) mit 5 mM Formaldehyd angezüchtet werden und durch Zugabe von Galaktose (Endkonzentration 3%) die Synthese der Hantavirusproteine induziert wird.
12. Verfahren nach den Ansprüchen 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Hefezellen durch Glasperlen aufgeschlossen werden.
13. Verfahren nach den Ansprüchen 7 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die rekombinanten Hantavirusproteine durch zwei aufeinanderfolgende Cäsiumchlorid- Dichtegradienten-Zentrifugationen oder durch Anreicherung der unlöslichen Proteine und anschließende Nickelchelat-Affinitätschromatografie gereinigt werden.
14. Verwendung der rekombinanten Hantavirusproteine nach Anspruch 1 als wirksame Komponenten in Hantavirus-Impfstoffen.
15. Verwendung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass Nukleokapsidproteine und/oder Glykoproteine
  • 1. 15.1. von Hantaviren
  • 2. 15.2. der Hantavirus-Serotypen Puumala, Dobrava und/oder Hantaan
  • 3. 15.3. der Hantavirus-Stämme Puumala-Vranica/Hällnäs, Dobrava-Slovakia und/oder Hantaan- Fojnica
als wirksame Komponenten in Hantavirus-Impfstoffen eingesetzt werden.
16. Verwendung von Hefezellen nach den Ansprüchen 1, 5 und 6, insbesondere Saccharomyces cerevisiae, vorzugsweise des Stammes fh4c, zur Herstellung rekombinanter Hantavirusproteine.
17. Verwendung der rekombinanten Hantavirusproteine nach den Ansprüchen 1 bis 4 in der Diagnostikaentwicklung.
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