CN102076366B - 组织工程血管 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了使用组织工程血管为患有脉管疾病的患者修复和再生血管的组合物和方法。

Description

组织工程血管
相关专利申请
本专利申请为美国临时专利申请No.61/049067的非临时性专利申请。
技术领域
本发明涉及用于治疗脉管疾病的组织工程血管。具体地讲，本发明提供了由支架和一种或多种细胞、细胞片层、细胞裂解液、组织糜及生物反应器处理制备的组织工程血管，用于修复或置换受损或病变的原生血管。
背景技术
心血管相关疾病是发达国家的首要死亡原因。仅在美国，每34秒就会发生一起心血管死亡事件，与心血管疾病相关的花费为大约2500亿美元。目前治疗脉管疾病的方法包括化疗方案、血管成形术、支架插入法、重建手术、旁路移植术、病变组织切除法或者切断术。不幸的是，对于许多患者而言，此类治疗方式的成功率很有限，并且部分患者病症或症状会恶化。
这些疾病通常需要重建和更换血管。目前，最常用的血管更换来源为自体同源的动脉和静脉。然而，此类自体同源脉管供给不足，或者并不适用，特别是患有脉管疾病或先前已做过手术的患者。
由诸如聚四氟乙烯(PTFE)和涤纶之类的材料制成的合成移植物是常用的血管替代物。尽管这种替代物比较常用，但合成材料并不适用于小直径移植物或血液流量低的区域。已证实存在一些与材料相关的问题，例如狭窄、血栓栓塞、钙沉积和感染。
因此，临床需要有利于组织侵润以便修复/再生病变或受损组织的生物相容性的和可生物降解的结构基质。通常，修复受损或病变血管组织的临床方法不能基本恢复它们的原有功能。因此，迫切需要一种可避免出现与目前临床方法相关的常见问题的组织修复/再生替代方法。
组织工程的出现可提供修复和再生受损/病变组织的替代方法。组织工程策略已研究了将生物材料与细胞、生长因子、生物活性物质和生物反应器处理结合使用，以开发最终可恢复或改善组织功能的生物替代物。已大量研究了可移植和可重塑的支架材料作为组织模板、导管、屏障物和储器。具体地讲，泡沫和纺织物形式的合成和天然材料已在体外和体内用于重建/再生生物组织，以及递送诱导组织生长的试剂。
已成功地在体外制备了此类组织工程血管(TEBV)并已用于动物模型。然而，临床成功案例还非常有限。
无论支架和目标组织的组成如何，模板必须具有一些基本特性。支架必须是生物相容的，具有足以抵抗手术时所施加的物理力的机械性能、足以允许细胞侵入或生长的多孔性，并且易于消毒，能够通过侵入组织进行重塑，而且在新组织形成时是可降解的。此外，可用机械手段、固定装置或粘结剂将支架固定在周围的组织上。迄今为止，单独使用或组合使用的常规材料都缺乏上述标准中的一者或多者。因此，需要能解决常规材料的潜在缺陷的支架。
发明内容
本发明公开了一种组织工程血管(TEBV)，其由生物相容的可生物吸收性支架以及一种或多种细胞、细胞片层、细胞裂解液、组织糜构成，并且采用或未采用生物反应器处理培养。此类组织工程血管可用于修复或置换受损或病变的原生血管。在一个实施例中，组织工程血管由生物相容的可生物吸收性支架和细胞构成。在另一个实施例中，组织工程血管由生物相容的可生物吸收性支架和细胞片层构成。在另一个实施例中，组织工程血管由生物相容的可生物吸收性支架和细胞裂解液构成。在又一个实施例中，组织工程血管由生物相容的可生物吸收性支架和组织糜构成。此外，可将细胞、细胞片层、细胞裂解液和组织糜的多种组合与生物相容的可生物吸收性支架相结合来形成组织工程血管。这些组织工程血管可在采用或不采用生物反应器处理的条件下培养。在一个实施例中，组织工程血管通过与生物活性剂组合而得到加强。
附图说明
图1。在培养物中培养3天和7天后，源于人脐带的细胞(hUTC)在血管移植生物材料上的附着和生长。A：3天后的PDO-ESS支架；B：7天后的PDO-ESS支架；C：3天后的PDO/胶原-ESS支架；D：7天后的PDO/胶原-ESS支架。所有图象均放大40倍。
图2。在培养物中培养3天和7天后，平滑肌细胞(UASMC)在血管移植生物材料上的细胞附着和生长的代表性实例。A：3天后的100mg/ml PDO-ESS支架；B：7天后的100mg/ml PDO-ESS支架；C：3天后的140mg/mlPDO-ESS支架；D：7天后的140mg/ml PDO-ESS支架。所有图象均放大40倍。
图3。在培养物中培养3天和7天后，内皮细胞(HUVEC)在血管移植生物材料上的细胞附着和生长的代表性实例。A：3天后的100mg/ml PDO-ESS支架；B：7天后的100mg/ml PDO-ESS支架；C：3天后的140mg/mlPDO-ESS支架；D：7天后的140mg/ml PDO-ESS支架。所有图象均放大40倍。
图4。细胞对裂解产物增强的PDO-ESS支架的附着。给PDO-ESS支架加载两种不同浓度的hUTC细胞裂解液并冻干。然后将细胞(50,000/支架)接种到支架上，培养3天和7天，然后进行活/死细胞染色。(A)3天后的对照支架；(B)7天后的对照支架；(C)3天后的用18mg/ml细胞裂解液增强的支架；(D)7天后的用18mg/ml细胞裂解液增强的支架；(E)3天后的用5.2mg/ml细胞裂解液增强的支架；(F)7天后的用5.2mg/ml细胞裂解液增强的支架。所有图象均放大40倍。
图5。在用细胞裂解液增强的PDO-ESS支架上培养的细胞的DNA含量。给PDO-ESS支架加载两种不同浓度(低浓度＝5.2mg/ml，高浓度＝18mg/ml)的hUTC细胞裂解液并冻干。然后将细胞(50,000/支架)接种到支架上，培养3天，然后分析细胞的DNA含量。洗涤样品，用木瓜蛋白酶消化，并使用CyQuant NF测定试剂盒进行DNA定量。
图6。与大鼠SMC培养24小时的涂覆有PBS或hUTC细胞裂解液的管状支架显示，通过活/死细胞染色和H&E图象
表明涂覆有细胞裂解液的支架具有更多的细胞附着。
图7。接种培养11天后，预先涂覆有hUTC细胞裂解液的接种有hUTC的PDO片的H&E染色。尽管仅将细胞接种到一个侧面上，但细胞可在整个支架中迁移和渗透。盒子？
图8。滚压管草图示出了活-死细胞染色实验的取样区域。在静态培养中，位置1c2为管的底部，a和b为管的侧面，1d2为管的顶部。
图9。来自接种有rSMC的片层(50微米厚)的滚压PDO管的H&E染色。
图10。在2mm管状支架上接种hUTC。将直径为2mm的PDO-ESS管状支架(A)和涂覆有鼠尾I型胶原的PDO-ESS管状支架(B)固定至LumeGen生物反应器室，并通过在内腔中填充5.5×105个细胞/毫升的细胞悬浮液进行接种。然后以0.4rpm将该室旋转过夜，通过活/死细胞染色进行分析。所有图象均放大100倍。
图11。在管状支架上接种大鼠主动脉平滑肌细胞。将PDO-ESS管状支架(A)和PDO/胶原-ESS管状支架(B)固定至LumeGen生物反应器室，并通过在内腔中填充2×106个细胞/毫升的细胞悬浮液进行接种。然后以0.4rpm将该室旋转过夜，通过活/死细胞染色进行分析。所有图象均放大100倍。
图12。管状支架上的大鼠主动脉平滑肌细胞暴露于流体流，或进行7天的静态培养。将约5cm长的PDO-ESS管状支架固定至LumeGen生物反应器室，并通过在内腔中填充2×106个细胞/毫升的细胞悬浮液进行接种。然后以0.4rpm将该室旋转过夜。第二天，将管状支架连接至LumeGen生物反应器，并暴露于流速为10ml/min的流体2小时。然后通过活/死细胞染色分析一个管状支架。(A)管的左侧。(B)管的右侧。将另一个管状支架再静态孵育7天，然后通过活/死细胞染色进行分析。(C)管的左侧。(D)管的右侧。所有图象均放大100倍。
图13。管状支架上的大鼠主动脉平滑肌细胞暴露于动态或静态培养条件。将约5cm长的PDO-ESS管状支架固定至LumeGen生物反应器室，通过在内腔中填充2×106个细胞/毫升的细胞悬浮液进行接种。然后以0.4rpm将该室旋转过夜。第二天，将管状支架连接至LumeGen生物反应器，并在流速为20ml/min、频率为1Hz的范围为120-80mm Hg的脉动压力的条件下暴露于流体3天。在静态条件下将另一个管状支架培养相同的时间周期。然后通过活/死细胞染色分析两个管状支架。(A)静态培养管的左侧。(B)静态培养管的右侧。(C)动态条件下培养的管的左侧。(D)动态条件下培养的管的右侧。所有图象均放大100倍。
图14。图象显示大鼠肌组织糜以不同量的组织均匀分布在管状构造体上。
图15。培养72小时后，图象显示组织糜仍附着在管状支架上。
图16。将大鼠平滑肌细胞接种(静态)在PDO管上持续4天，然后在生物反应器中保持10天(H&E染色)
具体实施方式
本发明公开了一种组织工程血管(TEBV)，其由生物相容的可生物吸收性支架以及一种或多种细胞、细胞片层、细胞裂解液、组织糜构成，并且采用或未采用生物反应器处理培养。此类组织工程血管可用于修复或置换受损或病变的原生血管。在组织工程中，身体对支架的重吸收速率优选接近组织置换支架的速率。也就是说，相对于组织置换支架的速率，支架的重吸收速率必须使得对支架所需的结构完整性(如强度)能够维持所需的时间长度。如果支架降解，并且吸收速率过度快于支架被其中生长的组织置换的速率，那么支架会表现出强度减小并且可能会发生装置失效。那么，可能会需要进行另外的手术以取出失效的支架并修复受损的组织。因此有利的是，本发明的装置使生物降解性、重吸收性、随时间推移的结构完整性以及利于组织向内生长的能力等性能保持平衡，其中每种性能都是组织再生或修复所期望的、有用的或必需的。较于现有技术的装置此类装置可提供协同改善。
总起来讲，有利的是对用于制备支架的合适可生物降解聚合物进行构造以使其具有适于预期应用的机械性能，可保持足够的完整性直至组织向内生长并愈合，不会引起最低程度的炎性反应或毒性反应，能够承受长期的血液动力学应力而不会发生材料失效，既能抗血栓形成又能抗感染，并可在达成其目的后在体内被代谢，易于加工成待形成的所需终产品，具有可接受的储存寿命，而且易于消毒。
可生物降解的生物相容性支架可以由天然的可生物降解聚合物、改性的天然可生物降解聚合物或合成的可生物降解聚合物构成，包括均聚物、共聚物和嵌段聚合物、直链或支链的聚合物、链段聚合物或无规聚合物，以及它们的组合。尤其适用的合成可生物降解性聚合物为脂族聚酯，其包括但不限于丙交酯(其包括乳酸D-丙交酯、L-丙交酯和内消旋丙交酯)、乙交酯(包括乙醇酸)、ε-己内酯、对二氧杂环己酮(1，4-二氧杂环己-2-酮)和三亚甲基碳酸酯(1，3-二氧杂环己-2-酮)的均聚物和共聚物。在一个实施例中，聚合物为聚(对二氧杂环己酮)、聚(丙交酯-co-乙交酯)(PLA/PGA)共聚物(95/5、85/15、10/90摩尔-摩尔％)和聚(乙交酯-co-己内酯)(PGA/PCL)65/35共聚物，以及聚(丙交酯-co-己内酯)(PLA/PCL)(60/40摩尔-摩尔％)共聚物。
合适的天然聚合物包括但不限于胶原、去端肽胶原(atelocollagen)、弹性蛋白和纤维蛋白以及它们的组合。在一个实施例中，天然聚合物为胶原。在另一个实施例中，天然聚合物的组合为非细胞网膜基质。
支架的维度反映了所需的范围，其与一种或多种细胞、细胞片层、细胞裂解液、组织糜以及生物反应器处理相结合将可置换较小直径的受损或病变静脉或动脉血管。所需的维度包括但不限于：内径(优选为3-7mm，最优选为4-6mm)；壁厚度(优选为0.1-1mm，最优选为0.2-0.7mm)；和长度(优选为1-20cm，最优选为2-10cm)。下表示出了我们的PDO构造体的性质与天然脉管的性质的一致性。
尺寸       物理性质
Figure BPA00001287225200061
支架的物理性质反应了所需的范围，其与一种或多种细胞、细胞片层、细胞裂解液、组织糜以及生物反应器处理相结合将可置换较小直径的受损或病变静脉或动脉血管。期望的物理特性包括但不限于：顺应性(优选为0.2-10％，最优选为0.7-7％)；缝线保持强度(优选为100gm-4Kg，最优选为100-300gm)；破裂强度/压力(优选为1000-4500mm Hg，最优选为1500-4500mm Hg，在生物反应器处理中大于100mmHg)；抗弯折性(在细胞接种、生物反应器、移植处理和患者生命的各个阶段中进行处理时均可以抗弯折)；以及体外强度保持力(1天至1年内保持足够的强度直至细胞和ECM生长可超过支架的物理特性损失；优选在生物反应器“流动”条件下保持1天至3个月)。支架还应具有所需的拉伸特性(径向和轴向拉伸特性)，其包括但不限于：纵向/轴向弹性模量(MPa)(优选为1-200；最优选为5-100)、正交/径向弹性模量(优选为0.1-100，最优选为0.5-50)、无规弹性模量(优选为0.1-100，最优选为0.5-50)以及润湿/纵向弹性模量(优选为5-100，最优选为25-75)；纵向/轴向峰值应力(MPa)(优选为1-30；最优选为2-20)、正交/径向峰值应力(优选为0.5-15，最优选为1-10)、无规峰值应力(优选为0.5-15，最优选为1-10)以及润湿/纵向峰值应力(优选为1-30，最优选为2-20)；纵向/轴向失效应变(％)(优选为1-200，最优选为5-75)、正交/径向失效应变(优选为5-400，最优选为10-300)、无规失效应变(优选为5-400，最优选为10-300)以及润湿/纵向失效应变(优选为1-200，最优选为20-100)。
支架的形态反应了所需的范围，其与一种或多种细胞、细胞片层、细胞裂解液、组织糜以及生物反应器处理相结合可置换较小直径的受损或病变静脉或动脉血管。期望的形态包括但不限于：孔径(优选为1-200um，最优选小于100um)；孔隙度(优选为40-98％，最优选为60-95％)；表面积/体积(优选为0.1-7m2/cm3，最优选为0.3-5.5m2/cm3)；透水性(优选为1-10ml cm2/min(80-120mmHg)，最优选为＜5ml cm2/min(120mmHg))；以及聚合物/纤维的取向(可允许进行适当的细胞接种、附着、生长和ECM形成)。聚合物/纤维取向也使能进行适当的细胞迁移；对组织糜片段也很重要使得细胞可迁移出片段并移动到支架上。
支架的生物相容性反应了所需的支架特性，其与一种或多种细胞、细胞片层、细胞裂解液、组织糜以及生物反应器处理相结合可置换较小直径的受损或病变静脉或动脉血管。期望的生物相容性包括但不限于：吸收性(优选为1周至4年，最优选为4周至30周，以允许细胞和ECM占据尽可能最大的支架体积)；组织反应(最低限度)；细胞相容性(支架不会对附着、生活力、生长、迁移和分化造成负面影响)；残余溶剂(最低限度)；残余EtO(最低限度)；以及血液相容性(不会形成血栓)。
支架具有的其他因素反应了所需的支架性质，其与一种或多种细胞、细胞片层、细胞裂解液、组织糜以及生物反应器处理相结合可置换较小直径的受损或病变静脉或动脉血管。期望的因素包括但不限于：表面能(允许进行适当的细胞接种、附着、生长、迁移和ECM形成)；表面化学(加有诸如氧气、表面粗糙度或表面特征(可用于影响细胞附着和其他细胞功能)、表面纳米级特征物(尺寸优选在10-1200纳米的范围内、更优选在25-900纳米的范围内(可允许内皮细胞优选附着))、NO、自由基清除剂之类的因素，可允许进行适当的细胞接种、附着、生长和ECM形成)；细胞介质(加有诸如基质蛋白之类的因素，可允许进行适当的细胞接种、附着、生长、迁移和ECM形成)；疏水性/亲水性(疏水性/亲水性的适当平衡可允许进行合适的细胞接种、附着、生长和ECM形成)。其他表面改性包括以在表面上涂覆流电材料的形式提供微电流。具体地讲，锌和铜(0.01微米-0.1微米)可用作增强内皮和平滑肌细胞附着和增殖的电流源。
可用于本发明的支架的非限制性例子包括：纺织物结构物例如毛毡、机织物、针织品、编织物、网状物、非织造物、经编针织物；泡沫，包括多孔泡沫和半孔泡沫；打孔的薄膜或片材；图案化的薄膜或片材或纤维；以及它们的组合。如本文所用，术语“非织造织物”包括但不限于通过除纺丝、机织或针织之外的方法制备的粘合织物、成型织物或工程织物。更具体地讲，术语“非织造织物”指多孔的类纺织物材料，通常是扁平片材的形式，主要或完全由组装成纤维网、片材或毡合织物的短纤维构成。纤维直径优选为10nm至100um，更优选为25nm至10um。在一个实施例中，支架为纺织物、泡沫以及它们的组合。
在另一个实施例中，支架为由纤维构成的纺织物，其中所述纤维通过静电纺丝、挤出、注模以及任何预处理或后处理(例如，通过激光切割形成挤出管中的流注)制备而成。在一个实施例中，支架为通过静电纺丝制备的纺织物。在静电纺成支架工艺中，向聚合物溶液施加电力，该溶液克服溶液的表面张力，从而形成带电射流。将该溶液射流喷射到基材上，并干燥和固化，形成由静电纺成纤维构成的片材、管材或其他构造体。聚合物溶液的可纺性由若干参数控制，这些参数包括但不限于：浓度(使得聚合物/溶剂溶液能进行纺丝并生成可形成合适支架的纤维的浓度，优选为1-50w/v％)；溶剂(可以给定浓度范围溶解聚合物的溶剂，优选HFIP)；溶液粘度(优选为10-300mg/ml，最优选为25-250mg/ml(50-3000厘泊))。通过控制纺丝条件，所得纤维可在约0.1μm至约10μm的范围内，优选在约0.3μm至约5.0μm的范围内。
静电纺丝的其他重要工艺参数包括但不限于：电势(优选为10-100kV，最优选为15-30kV)；流速(优选为0.1-20ml/hr，最优选为1-15ml/hr)；间隙/顶端距离(优选为1-35cm，最优选为2.5-25cm)；旋转/轴柄速率/速度(优选为10-5,000rpm，最优选为50-3000rpm)。也可以用熔融物纺成纤维。
任选地，可通过粘合上述构造体的纤维来增加静电纺成支架(ESSC)的强度。可通过在ESSC上涂覆低熔点材料(例如PCL)和低分子PLGA共聚物完成纤维的粘合。涂覆支架后，可用压烫机进行后处理。该处理会熔融强化纤维上的涂层。对静电纺成纤维之间的熔化涂层进行压制，在冷却至室温后纤维熔合在一起。作为另外一种选择，在静电纺丝工艺过程中，将静电纺成纤维暴露于溶剂蒸汽。固化后，纤维熔合在一起，从而强化了支架。
在一个实施例中，纺织物和ESSC支架由聚合物制成，所述聚合物包括但不限于聚(对二氧杂环己酮)、聚(丙交酯-co-乙交酯)(PLA/PGA)共聚物(95/5、85/15、10/90摩尔-摩尔％)和胶原。
在另一个实施例中，支架为泡沫。在一个实施例中，泡沫支架由弹性体共聚物制成。合适的生物相容的可生物吸收性弹性体共聚物包括但不限于ε-己内酯和乙交酯的共聚物(ε-己内酯与乙交酯的摩尔比优选为约30∶70至约70∶30，优选为35∶65至约65∶35，更优选为45∶55至35∶65)；ε-己内酯和丙交酯的弹性体共聚物，包括L-丙交酯、D-丙交酯、它们的共混物或乳酸共聚物(ε-己内酯与丙交酯的摩尔比优选为约35∶65至约65∶35，更优选为45∶55至30∶70)；对二氧杂环己酮(1，4-二氧杂环己烷-2-酮)和丙交酯的弹性体共聚物，包括L-丙交酯、D-丙交酯和乳酸(对二氧杂环己酮与丙交酯的摩尔比优选为约40∶60至约60∶40)；ε-己内酯和对二氧杂环己酮的弹性体共聚物(ε-己内酯与对二氧杂环己酮的摩尔比优选为约30∶70至约70∶30)；对二氧杂环己酮和三亚甲基碳酸酯的弹性体共聚物(对二氧杂环己酮与三亚甲基碳酸酯的摩尔比优选为约30∶70至约70∶30)；三亚甲基碳酸酯和乙交酯的弹性体共聚物(三亚甲基碳酸酯与乙交酯的摩尔比优选为约30∶70至约70∶30)；三亚甲基碳酸酯和丙交酯的弹性体共聚物，包括L-丙交酯、D-丙交酯、它们的共混物或乳酸共聚物(三亚甲基碳酸酯与丙交酯的摩尔比优选为约30∶70至约70∶30)；以及它们的共混物。在一个实施例中，弹性体共聚物为聚(乙交酯-co-己内酯)(PGA/PCL)65/35共聚物或聚(丙交酯-co-己内酯)(PLA/PCL)(60/-40摩尔-摩尔％)共聚物。
泡沫支架可通过常规工艺制备，例如冻干、超临界溶剂发泡(即，如EP 464,163B1中所述)、注气挤出、注气成型或用可提取物质浇铸。在一个实施例中，泡沫通过冻干制备。适用于将弹性体聚合物(例如如65/35PGA/PCL)冻干以形成泡沫的方法在转让给Ethicon，Inc的美国专利6,355,699，“Process for Manufacturing Biomedical Foams”(制备生物医学泡沫的方法)的实例中有所描述，将该专利全文以引用方式并入本文中。
在另一个实施例中，作为形成孔的另一种方法，可以在支架中引入可滤取物。合适的可滤取固体包括无毒可滤取材料，例如盐(如氯化钠、氯化钾、氯化钙、酒石酸钠、柠檬酸钠等)；生物相容性单糖和二糖(如葡萄糖、果糖、右旋糖、麦芽糖、乳糖和蔗糖)；多糖(如淀粉、海藻酸盐、脱乙酰壳多糖)；水溶性蛋白质(如明胶和琼脂糖)。
泡沫具有适于组织工程的微结构。可以通过在冻干过程中选择形成泡沫的适当条件来控制此类泡沫的特征以适合所需的应用。与支架通常为各向同性结构或无规结构的现有技术相比，可吸收聚合物的这些特征具有明显的优势。然而，优选的是，用于组织工程(即修复或再生)的泡沫具有可在微结构水平上提供组织化的结构特征，其可提供有利于细胞组织化和具有正常组织的解剖学、生物力学和生物化学特征的组织的再生的模板。这些泡沫可用于动物的组织修复或再生(包括器官)，例如家畜、灵长类动物和人类。
可通过选择合适的冻干条件控制此类泡沫的结构特征以适合所需的应用，来获得以下性质中的一者或多者：(1)可提供细胞向内生长和营养物质扩散的通道的尺寸在约10至约200μm(或更大)的范围内的互连孔；(2)在约20％至约98％的范围内，优选在约50％至约95％的范围内的多种孔隙度；(3)在进行优先细胞培养的一个方向上的孔径梯度；(4)用于改善细胞侵入、血管形成和营养物质扩散的穿过泡沫的通道；(5)用于细胞组织化的表面上的孔的微图案化；(6)孔形状和/或取向的可定制性(如大致球形、椭圆形、圆柱形)；(7)各向异性机械性能；(8)具有聚合物组成梯度的复合物泡沫以引起或利用对不同材料的不同细胞响应；(9)不同聚合物组分的共混物以形成具有可以不同速率分解的部分的结构；(10)与药物活性化合物共同冻干或用其涂覆的泡沫；(11)以及形成三维形状和具有优选微结构的装置的能力。可通过对表面孔隙度的控制以及可能增添的表面处理来优化支架的内层或内腔层以进行内皮化。同样通过优化孔隙度(孔隙度百分比、孔径、孔形状和孔径分布)以及通过掺入生物活性因子、药物制剂或细胞，可将支架的最外层或外膜层定制成可支持平滑肌细胞生长。可以有或可以没有设置在这两个多孔层之间的具有低孔隙度的屏障层以增加强度和降低渗漏。本文所述的支架的此类结构特征也可存在于纺织物中，例如静电纺成支架和本文所述的其他支架。
在一个实施例中，支架为泡沫和纺织物的组合。纺织物包括用作支架强化物的机织材料、针织物、经编针织物(即蕾丝状)、非织造材料以及编织结构。加固材料应具有足以允许缝合的密度，但密度不应过大以至于妨碍泡沫与纺织物之间的适当粘合。加固材料也可以由含孔的薄弹性体片材形成，此片材具有允许组织向内生长的孔。
例如，本发明还提供了复合支架，其包具有第一层(纺织物层)和第二层(生物相容性泡沫层或ESSC层)。该复合结构可允许生成具有独特机械性能的结构。在一个实施例中，纺织物层可允许使用缝线、缝钉或多种固定装置将复合材料保持在合适位置。一般来讲，纺织物的厚度通常在约1微米至500微米的范围内。纺织物层可使得复合物能根据设计、不同的生物吸收分布以及不同的细胞侵入和接种的微环境而具有不同的机械强度，这在多种医学应用中是有利的。纺织物层可以由多种生物相容性聚合物和生物相容性聚合物共混物制成，其优选是可生物吸收的。生物相容性泡沫或ESSC可具有梯度或具有通道。梯度结构在选自组成、刚度、柔韧性、生物吸收速率、孔结构和/或微结构的至少一种特性上具有基本上连续的过渡。梯度结构可由可吸收性聚合物的共混物制成，形成从第一聚合材料到第二聚合材料的组成梯度过渡。在单一化学组成足以满足应用的情况中，本发明提供了一种复合材料，该复合材料可在一个或多个维度上的结构中具有微结构变化，该变化可模拟组织的解剖学特征。有通道的结构可提供贯穿泡沫的通道以利于整个有通道的结构的细胞迁移和营养物质流动。
在另一个实施例中，泡沫或ESSC可具有熔合至顶部表面或底部表面的纺织物。这样，可控制结构的表面性能，例如孔隙度、渗透性、劣化速率和机械性能。如本文所述，纺织物可通过本文所述的常规技术制备，并且其中可在冻干泡沫表面上装配纺织物。纺织物可通过静电纺丝工艺制备，其中ESSC可在冻干泡沫表面上构造。
支架可包括泡沫或ESSC以及加固组分中每一者的一个或多个层。优选地，还通过使相邻层中的成孔网或壁至少部分互连将相邻的泡沫层或ESSC层一体化。
在一个实施例中，可用天然聚合物涂覆支架来增强细胞相容性。合适的天然聚合物包括但不限于胶原、去端肽胶原、弹性蛋白、透明质酸和纤维蛋白，以及它们的组合。在一个实施例中，天然聚合物为胶原。在另一个实施例中，天然聚合物的组合为非细胞网膜基质。
在一个实施例中，组织工程血管由生物相容的可生物吸收性支架和细胞构成。支架如上文所述。可与支架混合的合适细胞包括但不限于干细胞，例如专能或多能干细胞；祖细胞，例如平滑肌祖细胞和血管内皮祖细胞；胚胎干细胞；产后组织源细胞，例如胎盘组织源细胞和脐带组织源细胞；内皮细胞，例如血管内皮细胞；平滑肌细胞，例如血管平滑肌细胞；源自脂肪组织的前体细胞；以及动脉细胞，例如源自桡动脉和左右乳内动脉(IMA)(也称为胸廓内动脉)的细胞。
在一个实施例中，TEBV包括上文所述的支架和人脐带组织源细胞(hUTC)。分离和收集人脐带组织源细胞(hUTC)(也称为脐带源细胞(UDC))的方法在共同未决的美国专利No.10/877,012中有所描述，将其全文以引用方式并入本文中。在另一个实施例中，TEBV包括上文所述的支架、人脐带组织源细胞(hUTC)和一种或多种其他细胞。所述一种或多种其他细胞包括但不限于血管平滑肌细胞(SMC)、血管平滑肌祖细胞、血管内皮细胞(EC)或血管内皮祖细胞和/或其他专能或多能干细胞。支架上hUTC与一种或多种其他细胞的组合可以增强(例如)EC和SMC在支架上的接种、附着和增殖。hUTC还可促进EC或SMC或祖细胞在支架构造体中的分化。这可促进TEBV在体外培养期间的成熟以及体内移植期间的移植物移入。hUTC可提供营养支持，或提供和增强ECM蛋白质的表达。细胞(包括hUTC)的营养作用可引起患者血管平滑肌或血管内皮的增殖。细胞(包括hUTC)的营养作用可使血管平滑肌细胞、血管内皮细胞、骨骼肌祖细胞、血管平滑肌祖细胞或血管内皮祖细胞迁移至再生血管的一个或多个部位。
细胞可(在修复组织的手术之前或期间)从患者体内采集，并且可在无菌条件进行处理以获得特定的细胞类型。本领域的技术人员了解采集和提供上文所述细胞的常规方法，例如Osteoarthritis Cartilage 2007 Feb；15(2)：226-31中所描述的，将该文献全文以引用方式并入本文中。
可在即将移植之前将细胞接种至本发明的支架上持续短的一段时间(如少于一天)，或培养较长的时间(如多于一天)，以使得在移植之前能在接种的支架内进行细胞增殖和细胞外基质合成。在一个实施例中，在支架上接种单一细胞类型。在另一个实施例中，在支架上接种一种或多种细胞类型。多种细胞策略可用于这些支架(即自体同源细胞、同种细胞、异种细胞等)。
在另一个实施例中，对细胞进行基因修饰以表达负责促血管生成活性、抗炎活性、细胞存活、细胞增殖或分化或免疫调节的目的基因。
在另一个实施例中，组织工程血管由生物相容的可生物吸收性支架和细胞片层构成。细胞片层可以由hUTC或其他细胞类型制成。制备细胞片层的方法是如共同未决的美国专利申请No.11/304091中所描述的，将其全文以引用方式并入本文中。细胞片层可用涂覆有热敏聚合物的培养皿产生，该培养皿允许在温度降低的情况下收获完整的细胞片层。作为另外一种选择，制备细胞片层的其他方法包括但不限于在聚合物膜上培育细胞片层形式的细胞。可在玻璃、陶瓷或经表面处理的合成聚合物的表面上培养所选细胞。例如，经过表面处理(如伽马射线照射或涂覆硅涂层)的聚苯乙烯可以用作细胞培养表面。生长至超过85％汇合的细胞可在细胞生长支持装置上形成细胞片层。可用蛋白水解酶(例如胰蛋白酶或分散酶)将细胞片层从细胞生长支持装置分离。还可采用非酶细胞解离。非限制性例子包括以商品名CELLSTRIPPER(Mediatech，Inc.，Herndon，Va.)出售的螯合剂混合物、设计用于轻柔分离培养物中的粘合细胞同时降低与酶处理相关的损害风险的非酶细胞解离溶液。
作为另外一种选择，细胞生长支持装置的表面(可从其上收集培养细胞)可以是由可在不使用蛋白水解酶或化学材料的情况下将细胞与其分离的材料制成的培养床。该培养床材料可包括支承件和其上的涂层，其中涂层由水中临界溶解温度在0℃至80℃范围内的聚合物或共聚物形成。
在一个实施例中，通过将一个或多个细胞片层包裹在支架周围，将一个或多个细胞片层与上文所述的支架组合在一起。如上文所述，一个或多个细胞片层可以为相同的或不同的细胞类型。在一个实施例中，可将多个细胞片层组合在一起，形成牢固的血管构造体。例如，可将由内皮细胞和平滑肌细胞制成的细胞片层与支架组合以形成TEBV。作为另外一种选择，可将其他细胞类型(例如hUTC)的细胞片层与内皮细胞片层和支架组合以形成TEBV。此外，可将由hUTC制成的细胞片层包裹在由支架、EC和SMC构成的预成形TEBV周围，以提供支持该构造体成熟的营养因子。
细胞片层可在支架上生长，以给细胞片层提供强化和机械性能。可通过在支持装置上接种细胞之前，在支持装置的底部设置可生物降解的或不可生物降解的加固构件来形成强化的细胞片层。加固构件是如上文所述的。所得的细胞片层将使该加固支架整合，从而为细胞片层提供额外的强度，这可在不需要背衬层的情况下操作。优选的加固支架为由聚(二氧杂环己酮)构成的网片。可将网片置于
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超低吸附培养皿的底部。然后可以将细胞接种到培养皿上，使得它们可形成细胞-细胞相互作用，而且在它们与网片相互作用时会结合到网片上。这将会为强化的细胞片层提供更佳的强度和处理特性。此类强化的细胞片层可以卷成TEBV，或者可以将该强化对细胞片层设置在支架上(如上所述)。
在另一个实施例中，细胞片层是通过遗传工程方法制成的。遗传工程细胞片层包含细胞群体，其中细胞群体中的至少一个细胞转染有外源多核苷酸，该使得外源多核苷酸表达出快速诊断产物和/或治疗产物(如多肽或多核苷酸)以助于组织愈合、置换、维持和诊断。本发明所采用的“目的蛋白质”(和编码该蛋白质的基因)的例子包括但不限于细胞因子、生长因子、趋化因子、趋化肽、金属蛋白酶的组织抑制剂、激素、具有刺激或抑制作用的血管生成调节剂、免疫调节蛋白、神经保护和神经再生蛋白以及细胞凋亡抑制剂。更具体地讲，优选的蛋白质包括但不限于促红细胞生成素(EPO)、EGF、VEGF、FGF、PDGF、IGF、KGF、IFN-α、IFN-δ、MSH、TGF-α、TGF-β、TNF-α、IL-1、BDNF、GDF-5、BMP-7和IL-6。
在另一个实施例中，组织工程血管由生物相容的可生物吸收性支架和细胞裂解液构成。细胞裂解液可从细胞获得，所述细胞包括但不限于干细胞，例如专能或多能干细胞；祖细胞，例如平滑肌祖细胞和血管内皮祖细胞；胚胎干细胞；产后组织源细胞，例如胎盘组织源细胞和脐带组织源细胞；内皮细胞，例如血管内皮细胞；平滑肌细胞，例如血管平滑肌细胞；源自脂肪组织的前体细胞；以及动脉细胞，例如源自桡动脉和左右乳内动脉(IMA)(也称为胸廓内动脉)的细胞。细胞裂解液和细胞可溶性级分可刺激沿血管平滑肌或血管内皮途径分化。此类细胞裂解液及其级分具有许多效用。例如，在体内使用细胞裂解液可溶级分(即基本上不含细胞膜)使得能在患者体内异源利用有利的细胞内环境而无需引入可能引起排斥反应或其他不利的免疫反应的可观量的细胞表面蛋白。溶解细胞的方法是本领域熟知的，包括机械破碎、酶分解或化学分解或它们的组合等多种手段。此类细胞裂解液可由细胞直接在它们的生长介质中制备，因而含有分泌的生长因子等，或可在(例如)PBS或其他溶液中由不含介质的洗涤过的细胞制备。
在又一个实施例中，组织工程血管由生物相容的可生物吸收性支架和组织糜构成。组织糜具有至少一种可从组织片段迁移至支架的活细胞。更优选地，组织糜含有可从组织片段迁移并开始生活于支架上的有效量的细胞。组织糜可从一种或多种组织来源获得，或可以从一个来源获得。组织糜来源包括但不限于肌组织，例如骨骼肌组织和平滑肌组织；血管组织，例如静脉组织和动脉组织；皮肤组织，例如内皮组织；以及脂肪组织。
组织糜的制备方法如下：首先用合适的采集工具从供体(自体供体、同种供体或异种供体)获得组织样品。然后在采集组织时将组织样品切碎并分割成小片段，或者作为另外一种选择，在从体外收获和采集后将组织样品切碎。在组织样品在收获后切碎的实施例中，可将组织样品在磷酸盐缓冲盐水中洗三次。然后在Ham F12培养基内，在存在少量(例如约1ml)生理缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)或基质消化酶(例如0.2％的胶原酶)的情况下，将组织切碎成小片段。将组织切碎成大约0.1至1mm3大小的小块。切碎组织可通过多种方法完成。在一个实施例中，使用两把无菌手术刀在平行和相对方向切割来完成切碎，在另一个实施例中，可以用能够自动将组织分成所需尺寸的颗粒的加工工具将组织切碎。在一个实施例中，可使用本领域中普通技术人员已知的多种方法中的任一种方法将组织糜从生理流体中分离出来并浓缩，所述方法为例如筛分法、沉淀法或离心法。在一些组织糜被过滤并浓缩的实施例中，组织糜悬浮液优选在悬浮液中保持少量流体，防止组织变干。
通过将活组织悬浮液沉积在生物相容性支架上，使得组织和支架相连可将切碎的活组织的悬浮液用于产生根据本发明的TEBV。优选地，组织与支架的至少一部分相连。可将TEBV立刻植入受试者体内，或作为另外一种选择，可在可有效保持组织样品生活力的无菌条件下培养该构造体。
在本发明的另一方面，组织糜可包括两种不同组织糜来源的应用(如，可以在一个表面上涂覆内皮组织糜，在另一个表面上涂覆平滑肌组织糜)。
在一个实施例中，通过结合生物活性剂来增强由支架和一种或多种细胞、细胞片层、细胞裂解液或组织糜构成的组织工程血管。合适的生物活性剂包括但不限于抗凝血剂、抗炎剂、免疫抑制剂、免疫调节剂、促血管生成剂、抗凋亡剂、抗氧化剂、生长因子、血管生成因子、肌再生或肌保护药物、调理培养基、细胞外基质蛋白，例如胶原、去端肽胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白、玻璃粘连蛋白、腱生蛋白、整联蛋白、糖胺聚糖(透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸肝素、肝素、硫酸角质素等)、弹性蛋白和纤维蛋白；生长因子和/或细胞因子，例如血管内皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、类胰岛素生长因子和转化生长因子。
上文所述的来自细胞的调理培养基使得能在患者体内异源使用细胞分泌有利的营养因子而无需引入可能会引起排斥反应或其它不利的免疫反应的完整细胞。可通过在培养基中培养细胞，然后从培养基中移除细胞来制备调理培养基。由细胞群体(包括hUTC)制备的调理培养基可直接使用，也可进一步浓缩(例如，通过超滤或冻干)，或甚至还可以干燥、部分纯化、与本领域已知的可药用载体或稀释剂组合，或与其他生物活性剂组合。调理培养基可以在体外或体内单独使用或与(例如)自体同源或异源的活细胞组合使用。如果体内引入调理培养基，可在处理部位引入，或为患者远程提供所需的细胞生长或营养因子。该调理培养基还可用于TEBV的成熟。作为另外一种选择，hUTC或其他细胞调理培养基也可以在接种EC和SMC两者之前冻干到支架上。
从制备的角度看，hUTC或其他细胞或调理培养基可以缩短TEBV的体外培养或制备时间。这样还会使得用较少的起始细胞来制备EC和SMC的自体来源成为更可行的选择。
在一个实施例中，通过结合生物活性剂来增强由支架和一种或多种细胞、细胞片层、细胞裂解液或组织糜构成的组织工程血管。这些组织工程血管可在采用或不采用生物反应器处理的条件下培养。TEBV支架可用多种细胞培养生物反应器培养，包括但不限于转瓶、旋转壁式生物反应器(RWV)、灌注式生物反应器或者它们的组合。在一个实施例中，细胞培养生物反应器为旋转壁式生物反应器(RWV)或灌注式生物反应器。灌注式生物反应器包括用于固定TEBV支架的装置，允许培养基流经支架的内腔，并且还可允许在支架的内表面(内腔)和外表面上接种和培养细胞。灌注式生物反应器还能够产生脉动流和多种压力，用于在移植前调理接种细胞的支架。生物反应器处理过程中的脉动流应力(优选地，1天至1年内为1-25达因/cm2；更优选的是，2至4周内从1-25达因/cm2逐渐增大)。
可将具有细胞、细胞片层、细胞裂解液或组织糜以及任选的生物活性剂的支架培养较长的周期(例如多于一天)，以使得能在移植之前在支架内进行细胞增殖和基体合成。将细胞、细胞片层、细胞裂解液或组织糜施加至如上所述的支架上，并将其转移到生物反应器中进行长期的培养，或更优选在生物反应器内进行接种和培养。也可以连续使用多个生物反应器，例如一个用于细胞的初始接种，另一个用于长期培养。
用生物反应器在支架上接种和培养细胞的过程可以连续用多种细胞类型重复进行，例如接种平滑肌细胞并培养一段时间后，再接种和培养内皮细胞，或者同时进行(例如将平滑肌细胞接种在支架的外表面上，内皮细胞接种在支架的内表面(内腔)上)。该构造体可以培养一段时间以促进成熟，也可以不培养。可控制生物反应器的条件以促进该构造体的正常成熟。培养周期之后，可移出该构建体并将其移植进动物或人的血管部位中。
一般的细胞培养条件包括37℃的温度和5％的CO2。接种有细胞的构造体可在维持于生理pH值或接近该值的生理缓冲盐溶液中培养。培养基可补充有氧气以支持代谢呼吸。培养基可以是标准制剂，也可加以改进使其更好地支持该构造体中的细胞生长和成熟。培养基可含有缓冲液、盐、氨基酸、葡萄糖、维生素和其他细胞营养物质。培养基还可含有选择用于在该构造体内形成内皮和平滑肌细胞的生长因子。这些生长因子的例子可包括VEGF、FGF2、血管生成抑制素、内皮抑制素、凝血酶和血管紧张素II。也可将培养基灌注到该构造体内以促进构造体的成熟。这可包括在一定压力和流速下在脉管内腔中流动，所述压力和流速是该构造体在移植后可能要经受的压力和流速(或接近值)。
培养基是培养的细胞类型所特异性的(即内皮细胞培养基用于内皮细胞，平滑肌细胞培养基用于SMC)。对于灌注式生物反应器而言，还要考虑其他因素，例如但不限于剪切应力(与流速相关)、氧气张力和压力。
也可对TEBV进行电刺激来增强不同细胞类型的附着或增殖。电刺激可在制备TEBV之前的细胞培养和扩增期间、在TEBV的成熟阶段或在移植过程中进行。也可在制备调理培养基期间对细胞(包括hUTC)进行电刺激。
本发明还提供了在需要修复的血管位置处对插入上文所述TEBV的组织进行修复或再生的方法。这些TEBV结构尤其适用于两种或更多种不同类型组织之间的组织的再生。对于在最简单的情况下的多细胞体系而言，在支架的一个面上可以存在一种细胞类型，而在支架的另一个面上可存在第二种细胞类型。此类再生的例子可以是在外侧具有平滑肌而在内侧具有内皮细胞的血管组织以用于再生血管结构。
本发明还涉及用通过本文所述的方法制备的TEBV处理组织的方法。TEBV可用于动静脉移植、冠状动脉移植或外周动脉移植。例如，在用于治疗末期肾衰竭患者的典型AV(动静脉)外科手术中，外科医生切开前臂的皮肤和肌肉。选择动脉和静脉(通常为桡动脉和头静脉)并在其中分别作切口。然后将TEBV用于使动脉和静脉的末端吻合。然后将肌肉和皮肤闭合。在移植物已正常痊愈后(4-6周)，可将该成功形成的旁路用于处理患者的血液。
在冠状动脉旁路(CABG)手术中，用TEBV对患有动脉硬化的患者进行治疗，动脉硬化是一种表征为动脉壁增厚、失去弹性以及钙化的常见动脉疾病。动脉硬化会导致血液供应量减少，从而损坏心脏，导致中风和心脏病发作。在典型的CABG手术中，外科医生通过胸骨切开术打开胸腔。心脏功能由心肺机替代。找到病变动脉，将TEBV的一端缝合到冠状动脉上，越过阻塞处，将另一端连接到主动脉上。让心脏恢复跳动，将胸骨连接在一起，并缝合切口。成功完成旁路手术后，几周内患者可完全痊愈，并且身体机能恢复正常。
以下实例旨在说明本发明的原理和实践，而非限制本发明。一旦具有本公开的有益效果，本发明范围和精神内的许多其他实施例对本领域技术人员来说将显而易见。
实例
实例1.通过静电纺丝工艺制备的可生物吸收聚合物管的状支架
PDO静电纺丝管
1)采用高浓度(140mg/ml)
用1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇(HFP，TCI America Inc.，Portland，OR)溶剂制备140mg/mL的聚(对二氧杂环己酮)(PDO)(Ethicon，Inc.，Somerville，NJ)溶液。将溶液留在箱子(黑暗环境)中在摇动器板上过夜摇动，以确保所有PDO溶解并形成均相溶液。然后将4mL聚合物溶液吸入塑料注射器(5ml)(Beckton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)中，并置于注射器泵(KD Scientific型号100，Holliston，MA)中，以8ml/h的速率进行分配。使用高压电源(Spellman CZE1000R；Spellman High Voltage Electronics Corporation，Hauppauge，NY)向固定到装有所述溶液的注射器上的平口18号注射针施加+25kV的电压。在距离针尖8英寸以约400rpm旋转的5mm直径的圆柱形接地轴柄上将溶液进行静电纺丝，以制备无规取向纤维支架。轴柄的平移距离为18cm，并且平移速度为18cm/s，以确保沿着轴柄的长度方向进行均匀覆盖。静电纺丝后，立即快速地将轴柄和支架浸入乙醇浴中，并小心地将支架从轴柄上滑出。然后将管(内径：5mm，厚度：约500微米，长度：10cm)放置于通风橱中30分钟，以蒸发所有残余的乙醇。
2)采用中等浓度(100mg/ml)
100mg/ml PDO溶液的制备方式如下：将该聚合物加入HFP溶剂中，使溶液于黑暗环境中在摇动器板上摇动过夜，以确保所有PDO溶解并形成均相溶液。然后将所需量的聚合物溶液吸入塑料Beckton Dickinson注射器中，并放置于注射器泵中，以10ml/hr的速率进行分配。使用两个高压电源。一个用于为固定到装有溶液的注射器上的平口18号注射针施加+20kV的电压，而另一个用于为放置在接地轴柄(直径为2或5mm)后方6英寸处并且直径为5英寸的扁平金属靶材提供-8kV的电压。接地轴柄距离针尖8英寸，以约400rpm的速率旋转，以制备无规取向纤维支架。轴柄的平移距离为18cm，平移速度为18cm/s。对于管状构造体而言，在静电纺丝后，立即快速地将轴柄和支架浸入乙醇浴中，以助于管从轴柄上滑出。然后将管放置于通风橱中30分钟，以蒸发所有残余的乙醇。
3)采用低浓度(60mg/ml)
用HFP溶剂制备60mg/mL PDO溶液。将溶液留在箱子(黑暗环境)中在摇动器板上过夜摇动，以确保所有PDO溶解并形成均相溶液。然后将15mL该聚合物溶液吸入塑料Beckton Dickinson注射器(30ml)中，并放置于注射器泵中，以12ml/h的速率进行分配。使用两个高压电源。一个用于为固定到装有溶液的注射器上的平口18号注射针施加+22kV的电压，而另一个用于为放置在接地轴柄后方6英寸处的扁平金属靶材提供-10kV的电压。在距离针尖12英寸以约400rpm的速率旋转的直径为5mm的圆柱形接地轴柄上将溶液进行静电纺丝，以制备无规取向纤维支架。轴柄的平移距离为18cm，平移速度为18cm/s。静电纺丝后，立即快速地将轴柄和支架浸入乙醇浴中，并小心地将支架从轴柄上滑出。然后将管(内径：5mm，厚度：约500微米，长度：10cm)放置于通风橱中30分钟，以蒸发所有残余的乙醇。
85/15PLGA静电纺丝管
1)采用高浓度(120mg/ml)
用HFP溶剂制备120mg/mL聚(丙交酯-co-乙交酯)(Purac，Linolnshire，IL)溶液，丙交酯与乙交酯的摩尔比为85/15(85/15 PLGA)。将溶液装入箱子(黑暗环境)中，在摇动器板上过夜摇动，以确保所有85/15 PLGA溶解并形成均相溶液。然后将5mL聚合物溶液吸入塑料Beckton Dickinson注射器(5ml)中，并放置于注射器泵中，以8ml/h的速率进行分配。使用两个高压电源。一个用于为固定到装有溶液的注射器上的平口18号注射针施加+22kV的电压，而另一个用于为放置在接地轴柄后方6英寸处的扁平金属靶材提供-10kV的电压。在距离针尖8英寸以约400rpm旋转的5mm直径的圆柱形接地轴柄上将溶液进行静电纺丝，以制备无规取向纤维支架。轴柄的平移距离为18cm，平移速度为18cm/s。在静电纺丝之前，用一小段铝箔包裹轴柄，以助于移出管。在静电纺丝完成之后，使箔衬里从轴柄上滑出，然后小心地从管(内径：5mm，厚度：约500微米，长度：10cm)内侧将其移出。
2)采用低浓度(50mg/ml)
用HFP溶剂制备50mg/mL 85/15 PLGA溶液。将溶液装入箱子(黑暗环境)中，在摇动器板上过夜摇动，以确保所有85/15 PLGA溶解并形成均相溶液。然后将15mL该聚合物溶液吸入塑料Beckton Dickinson注射器(30ml)中，并放置于注射器泵中，以12ml/h的速率进行分配。使用两个高压电源。一个用于为固定到装有溶液的注射器上的平口18号注射针施加+22kV的电压，而另一个用于为放置在接地轴柄后方6英寸处的扁平金属靶材提供-5kV的电压。在距离针尖8英寸以约400rpm旋转的5mm直径的圆柱形接地轴柄上将溶液进行静电纺丝，以制备无规取向纤维支架。轴柄的平移速度设定为18cm/s。在静电纺丝之前，用一小段铝箔包裹轴柄，以助于移出管。在静电纺丝完成之后，使箔衬里从轴柄上滑出，然后小心地从管(内径：5mm，厚度：约500微米，长度：10cm)内侧将其移出。
实例2.通过静电纺丝工艺制备的可生物吸收聚合物和胶原管的状支架
1)胶原静电纺丝管
将浓度为120mg/ml的胶原(I型牛胶原蛋白(Bovine Collagen Type I)，Kensey Nash，Exton，PA)HFP溶液进行静电纺丝。混合胶原溶液，并将其放入暗箱中在摇动器板上放置过夜，以确保所有胶原均溶解。对于胶原管而言，将少量(0.2-0.5ml，具体取决于轴柄直径)的胶原溶液吸入1mlBeckton Dickinson注射器中，并静电纺丝到旋转的轴柄上，以便移出管。用平口18号注射针以3ml/hr的速率分配该胶原的预备涂层。将两个高压电源连接到针尖和放置在轴柄(直径为2或5mm)后方6英寸处、直径为5英寸的后靶上，并分别设定为+25kv和-10kv。接地轴柄距离带电针尖8英寸，并以约400rpm的速率旋转，以制备无规取向纤维支架。轴柄的平移距离为18cm，平移速度为18cm/s。完成预备性胶原牺牲层后，丢弃最初使用的注射器，将装有所需量的胶原溶液的新注射器置于注射器泵上。用与牺牲层相同的参数将该溶液进行静电纺丝。静电纺丝过程完成之后，从静电纺丝室中移出轴柄，小心地使移植物从轴柄上滑出。在该过程中，初始层被从移植物撕下，在轴柄上留下薄的一层胶原。
2)PDO和胶原静电纺丝管
50∶50 PDO∶胶原支架由体积比为50∶50的100mg/ml PDO和120mg/ml胶原(I型牛胶原蛋白(Bovine Collagen Type I)，Kensey Nash，Exton，PA)溶液构成。在单独的闪烁瓶中制备这两种聚合物溶液，制备条件与静电纺丝聚合物时相同，即分别将聚合物的HFP溶液放入暗箱中并置于摇动器板上过夜。聚合物完全溶解后，在新的闪烁瓶中将等量的两种溶液混合在一起，旋涡振荡30秒，然后放置于摇动器上。当两种溶液混合时，用与上述纯胶原管静电纺丝方案相同的方法，将少量的纯胶原溶液静电纺丝到接地轴柄上，作为牺牲层。完成初始胶原层的静电纺丝之后，将所需量的PDO∶胶原混合溶液吸入Beckton Dickinson注射器中，并静电纺丝到旋转的轴柄(直径为2或5mm)上，以便移出管。完成预备性胶原牺牲层后，丢弃最初使用的注射器，将装有所需量的胶原溶液的新注射器置于注射器泵上。如实例2部分1中所述，使用与牺牲层相同的参数将该溶液进行静电纺丝。
3)用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)使胶原与 PDO∶胶原ESS管交联
用溶于纯乙醇的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)将纯胶原支架以及实例2部分2和3中制备的PDO和胶原的共混物进行交联。将样品在40mM(50×HFP中胶原的摩尔浓度)EDC乙醇溶液中浸泡18小时，然后在0.1M磷酸二钠溶液中冲洗2小时，以使所有未反应的O-异酰基脲中间产物水解。交联之后，将样品在去离子水中冲洗，然后冷冻并冻干过夜，以去除所有残余的水分。
实例3.通过静电纺丝方法制备的可生物吸收聚合物PDO片状支架
100mg/ml PDO溶液的制备方式如下：将聚合物加入HFP溶剂中，并将该溶液放入暗箱中，在摇动器板上摇动过夜，以确保所有PDO溶解并形成均相溶液。然后将所需量的聚合物溶液吸入塑料Beckton Dickinson注射器中，并放置于注射器泵中，以10ml/hr的速率进行分配。使用两个高压电源。一个用于为固定到装有溶液的注射器上的平口18号注射针施加+20kV的电压，而另一个用于为放置在接地轴柄(直径为2.5cm)后方6英寸处的金属靶提供-8kV的电压。接地轴柄距离针尖8英寸，以约400rpm的速率旋转，以制备无规取向纤维支架。轴柄的平移距离为18cm，平移速度为18cm/s。静电纺丝后，立即快速地将轴柄和支架浸入乙醇浴中，以助于管从轴柄上滑出。将管切成片，然后放入通风橱中30分钟，以蒸发所有残余的乙醇。
实例4.通过静电纺丝工艺制备的可生物吸收聚合物和胶原的50∶50 PDO∶胶原片状支架
50∶50PDO∶胶原支架由体积比为50∶50的100mg/ml PDO和120mg/ml胶原溶液构成，制备方法如实例3所述。
然后用溶于纯乙醇的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)将50∶50的PDS∶胶原片材进行交联。将样品在40mM(50×HFP中胶原的摩尔浓度)EDC乙醇溶液中浸泡18小时，然后在0.1M磷酸二钠溶液中冲洗2小时，以使所有未反应的O-异酰基脲中间产物水解。交联之后，将样品在去离子水中冲洗，然后冷冻并冻干过夜，以去除所有残余的水分。
实例5.通过冻干工艺制备的可生物吸收聚合物的管状支架
1)35/65聚(己内酯-co-乙交酯)(35/65 PCL/PGA)冻干管(于1，4-二氧 杂环己烷中的10重量％溶液)
该实例描述了包含多孔结构的管的制备，其中多孔结构可为营养物质传送和引导的组织再生提供通道。因此，通过用9份1，4-二氧杂环己烷溶剂溶解1份35/65 PCL/PGA(Ethicon，Inc.，Somerville，NJ)，制备10％(w/w)的聚合物溶液。在具有磁力搅拌棒的烧瓶中制备该溶液。为了使共聚物完全溶解，将混合物缓慢加热至60℃，并持续搅拌过夜。然后用另外的粗过滤器(Pyrex牌砂心抽提套管(Pyrex brand extraction thimble with fritted disc))过滤该溶液，获得透明的均相溶液。
然后用冻干机(DURA-STOP，FTS Systems，Stone Ridge，NY)用聚合物溶液形成管。将冻干机通电，并将搁板室维持在-17℃，保持大约30分钟。连接用于监控搁板温度的热电偶，以便进行监控。将步骤A中制备的均相聚合物溶液注入1ml Beckton Dickinson(BD)注射器的圆筒与1ml BD注射器的活塞之间的间隙中，从而将注射器用作形成管的模具。将模具置于维持在-17℃(预冷却)的冻干机中。启动冻干循环，使搁板温度在-17℃下保持15分钟，然后在-15℃下保持120分钟。抽真空，通过升华来初始干燥二氧杂环己烷。将搁板温度升至-5℃，在该温度下保持60分钟。将搁板温度升至5℃，并保持60分钟。将搁板温度再升至20℃，在该温度下保持60分钟。开始第二阶段的干燥，将搁板温度在20℃下再保持120分钟。在第二阶段结束时，使冻干机恢复至室温和大气压力。将薄支架从注射器的活塞中移出。
2)35/65聚(己内酯-co-乙交酯)(35/65 PCL/PGA)冻干管(于1，4-二氧 杂环己烷中的5重量％溶液)
该实例描述了包含多孔结构的管的制备，其中多孔结构可为营养物质传送和引导的组织再生提供通道。因此，通过用9份1，4-二氧杂环己烷溶剂溶解1份35/65 PCL/PGA，制备5％(w/w)的聚合物溶液。在具有磁力搅拌棒的烧瓶中制备该溶液。为了使共聚物完全溶解，将混合物缓慢加热至60℃，并持续搅拌过夜。然后用另外的粗过滤器(Pyrex牌砂心抽提套管(Pyrex brand extraction thimble with fritted disc))过滤该溶液，获得透明的均相溶液。
然后用冻干机(DURA-STOP，FTS Systems，Stone Ridge，NY)用聚合物溶液形成管。将冻干机通电，并将搁板室维持在-17℃，保持大约30分钟。连接用于监控搁板温度的热电偶，以便进行监控。将步骤A中制备的均相聚合物溶液注入1ml BD注射器的圆筒与1ml BD注射器的活塞之间的间隙中，从而将注射器用作形成管的模具。将模具置于维持在-17℃(预冷却)的冻干机中。启动冻干循环，使搁板温度在-17℃下保持15分钟，然后在-15℃下保持120分钟。抽真空，通过升华来初始干燥二氧杂环己烷。将搁板温度升至-5℃，在该温度下保持60分钟。将搁板温度升至5℃，并保持60分钟。将搁板温度再升至20℃，在该温度下保持60分钟。开始第二阶段的干燥，将搁板温度在20℃下再保持120分钟。在第二阶段结束时，使冻干机恢复至室温和大气压力。将薄支架从注射器的活塞中移出。
实例6.聚(丙交酯)和聚(乙交酯)非织造管的制备
用多种可生物吸收细丝制备长度为大约50mm、内径为大约4mm且壁厚为大约0.5-1.0mm的非织造管。具体地讲，细丝由聚(丙交酯)(PLA)和聚(乙交酯)(PGA)以及摩尔比为90∶10的PGA与PLA的共聚物(90/10PGA/PLA)构成。用干法非织造技术制备这些样品，首先用直径为大约20微米、长度为大约50mm的细丝制备非织造毡合织物。然后用轴柄通过针刺法将该棉絮合并在一起。
实例7.涂覆有胶原的可吸收性合成组织工程管状支架的制备
用高纯度去端肽胶原(Colbar，a Johnson&Johnson Co.，Israel)涂覆按实例1-6和8-11所述制备的组织工程管状支架。将组织工程管状支架(实例1，部分2)放置在轴柄上并浸入含有1mg/ml胶原的10mM HCl溶液中。在室温下，将组织工程管状支架在胶原溶液中浸泡30分钟。从溶液中移出组织工程管状支架，并在室温下干燥8小时。
实例8.涂覆有非细胞网膜基质的组织工程管状支架的制备
在采集猪网膜后，将猪网膜置于0.9％的盐水中。用盐水溶液冲洗3次以洗去血液和其他外来的碎屑，然后将网膜置于70％的乙醇中30分钟。用70％的乙醇处理后，将组织置于100％的乙醇中脱水30分钟，并两次更换成新鲜乙醇。然后，将组织转移到丙酮中180分钟，每60分钟更换一次新鲜溶液。随后，将组织置于50∶50的丙酮/己烷的混合物中60分钟，然后置于20∶80的相同混合物中24-48小时(三次更换新鲜溶液)以去除脂质。然后，将组织转移到100％的乙醇中30分钟，随后转移到70％的乙醇中，如果有必要，可将其保存在4℃下直至开始脱细胞化处理。然后将组织浸入脱细胞缓冲液中30分钟，该缓冲液包含X-100(1％w/V；非离子去垢剂)(Sigma-Aldrich，St.Louis，NJ)和溶解于50mM Tris-HCl(pH7.2)中的MgCl2(1％)。然后在酶溶液中进行处理，该酶溶液包含与脱细胞缓冲液混合的核酸内切酶(BENZONASE；41.8U/ml，Sigma-Aldrich，St.Louis，NJ)。将组织在该溶液中旋转20小时。然后，将组织在含50mM Tris-HCl(pH 7.2)、5mM MgCl2和1％(W/V)
Figure BPA00001287225200261
X-100的溶液中洗涤两次(每次2小时)。然后，将组织置于pH值为7.0、含1M NaCl、20mm EDTA和0.2％(W/V)
Figure BPA00001287225200262
X-100的细胞提取溶液中1小时，之后，用超纯水洗涤组织(4次，每次5分钟)。在水洗(4次，每次20分钟)后，将该组织转移至含0.15％过乙酸(或醋酸)的80∶20水∶乙醇(200标准强度)消毒液中1小时，然后将组织保存于4℃的70％乙醇中。
将该非细胞网膜风干，然后在低温下磨成粉末。然后将粉末分散到浓度为5mg/ml的10mM HCl中。将实例1-6和9-11中所述的组织工程管状支架放置于轴柄上，并浸入非细胞网膜悬浮液中，用冻干法在-20℃下干燥24小时。然后在120℃的真空条件下，通过热脱水过夜，将浸渍的组织工程管状支架上的网膜基质进行交联。
实例9.PCL/PGA薄膜上细胞片层的生成
该实例描述了在薄膜上由人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)构成的细胞片层的生成。然后可将这些片层加工成管状结构，使得TEBV仅由人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)构成。将人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)接种到PCL/PGA薄膜上，以获得细胞片层。为此，通过将2.5ml聚合物溶液(二氧杂环己烷中的45/55 PCL/PGA 10％(w/w)溶液或二氧杂环己烷中的35/65PCL/PGA 10％(w/w)溶液)加到60mm培养皿上以浇铸薄膜。浇铸后，通过将薄膜放入乙醇中洗涤以进行消毒，并风干。通过胰蛋白酶处理获得HUVEC，并用Guava仪(Guava Technologies，Hayward，CA)计数。将细胞接种到薄膜上，接种密度为5000个细胞/cm2(141,350个细胞/60mm培养皿)，然后在37℃的培养箱中放置9天。用显微镜法或钙黄绿素染色法使细胞可视。HUVEC细胞在聚(己内酯-co-乙交酯35/65摩尔-摩尔％)(35/65PCL/PGA)薄膜或聚(己内酯-co-乙交酯45/55摩尔-摩尔％)(45/55 PCL/PGA)薄膜上长成汇合层，从而形成细胞片层。通过微观图象确认具有细胞汇合单层。通过钙黄绿素染色法，显示在第9天细胞发生附着和增殖，几乎没有死亡细胞的迹象。
将片层卷成管，形成可以单独或与机械支柱相结合以用作组织工程血管的构造体，例如实例1-8或11所述的支架。通过类似的方法(参见实例18和19)，细胞片层可以直接形成管。
实例10.PCL/PGA薄膜上细胞片层的生成
该实例描述了在薄膜上由人脐带组织源细胞(hUTC)构成的细胞片层的生成。通过美国专利号7510873中所述的方法获得人脐带组织源细胞，将该专利全文以引用方式并入本文中。将这些片层加工成管状结构，使得TEBV仅由hUTC构成。将hUTC接种到PCL/PGA薄膜上以获得细胞片层。为此，通过将2.5ml聚合物溶液加到60mm培养皿上来浇铸薄膜。浇铸后，通过将薄膜放入乙醇中洗涤以进行消毒，并风干。通过胰蛋白酶处理获得hUTC，并用Guava仪计数。将细胞接种到薄膜上，接种密度为5000个细胞/cm2(141,350个细胞/60mm培养皿)，然后放置在37℃的培养箱中。用显微镜法或钙黄绿素染色法使细胞可视。制备由hUTC和聚(己内酯-co-乙交酯35/65摩尔-摩尔％)(35/65 PCL/PGA)薄膜或聚(己内酯-co-乙交酯45/55摩尔-摩尔％)(45/55 PCL/PGA)薄膜构成的细胞片层。
将片层卷成管，形成可以单独或与机械支柱相结合以用作组织工程血管的构造体，例如实例1-8或11所述的支架。通过类似的方法(参见实例18和19)，细胞片层可以直接形成管。
实例11.冻干的、去细胞的细胞片层
该实例涉及用冻干的或去细胞的细胞片层制备TEBV。细胞片层将在体外生成，然后进行冻干或去细胞。在需要时，可将所需类型的细胞片层解冻，然后形成管状结构以制备TEBV。另一方面，可以将去细胞的细胞片层包裹在其他细胞片层上，通过提供营养因子支持或细胞外基质蛋白来增强TEBV构造体。
按照实例9、10和17所述生成细胞片层。获得细胞片层的其他方法包括在去细胞网膜(实例8)上、在塑料组织培养皿上或热敏培养皿(CellSeed，Inc，Tokyo，Japan)上培养细胞。用于获得细胞片层的细胞类型包括内皮细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞或hUTC。将细胞保存在培养物中直到获得单层。然后通过低温保存和后续的冻干处理(Core Dynamics，Orangeburg，NY)对所得的细胞片层进行玻璃化处理。
实例12.人脐带组织源细胞在PDO ESS支架上的附着和生长
该实例涉及用人脐带组织源细胞(hUTC)制备组织工程血管(TEBV)。TEBV可通过用人脐带组织源细胞接种血管移植物或支架材料而形成。设想当在体外接种或在移植后接种到血管移植物上时，将hUTC接种到TEBV上会增强内皮细胞(EC)和平滑肌细胞(SMC)的接种、附着和增殖。hUTC还可促进EC或SMC祖细胞向移植物构造体中的侵润以及随后的分化。这可以在体内移植过程中通过提供营养支持或提供ECM蛋白质的表达促进TEBV的成熟和移植。
对hUTC在PDO和PDO/胶原(50/50，交联)(实例1和2)ESS支架上的附着和生长进行评估。从支架材料制得直径为5mm的活检穿孔，并在完全培养基中进行预湿。然后将hUTC进行胰蛋白酶处理，计数并以200,000个细胞/ml的浓度重新悬浮于完全培养基中。将支架穿孔放置于96孔低簇板中，用100微升细胞悬浮液进行接种(20,000个细胞/穿孔)。让细胞在37℃下附着3小时，然后将支架转移到含1ml完全培养基的24孔低簇板上。将支架培养7天，3天后更换培养基。
在接种后第3天和第7天，将支架转移到含1ml无血清DMEM的新低簇24孔培养皿中。然后用另外的1ml无血清DMEM洗涤支架。制备包含2微摩尔钙黄绿素AM和4微摩尔乙锭均二聚物的活/死细胞染色储液(Invitrogen，Carlsbad，CA)，并在每个孔中加入0.5ml该溶液。在室温下孵育5分钟后，用荧光显微镜法评价细胞附着和生活力。
结果：hUTC在TEBV支架上附着并生长。与PDO-ESS支架相比，从第3天至第7天PDO/胶原-ESS支架显示出细胞数量更显著的增加(图1)。
实例13.人脐带动脉平滑肌细胞(UASMC)和人脐带静脉内皮细胞 (HUVEC)在PDO ESS支架上的附着和生长
对人脐带动脉平滑肌细胞(UASMC)和人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)在PDO ESS支架(100mg/ml和140mg/ml，实例1)上的附着和生长进行评估。将UASMC(Lonza Rockland Inc.，Rockland，ME)和HUVEC(LonzaRockland Inc.，Rockland，ME)接种到PDO ESS支架上，并在指定的时间点(第3天和第7天)通过活/死细胞染色评估在不同表面上生长的细胞的生活力。
将无菌PDO支架(5mm活检穿孔)放置于空的低簇96孔培养皿中，用PBS洗涤，然后浸入适当的培养基(HUVEC使用EGM-2，UASMC使用SmGM)中，同时进行细胞的胰蛋白酶处理。通过胰蛋白酶处理获得UASMC和HUVEC，计数并重新悬浮，使得SmGM(UASMC)或EGM-2(HUVEC)培养基中的最终密度为5×105个细胞/ml。将一百微升(50,000个细胞)的该储备细胞悬浮液以等份施加到支架上，让细胞在37℃的培养箱中附着3小时。然后将支架转移到含1ml相应培养基的24孔培养皿中培养3天和7天。
将支架转移到含1ml无血清DMEM的新低簇24孔培养皿中。然后用另外的1ml无血清DMEM洗涤移植物材料。制备在无血清DMEM中包含2微摩尔钙黄绿素AM和4微摩尔乙锭均二聚物的活/死细胞染色储液，并在每个孔中加入0.5ml该溶液。在室温下孵育5分钟后，用荧光显微镜法评价细胞附着和生活力。
结果：在7天培养期内所有样品显示出细胞的附着和生长(图2和3)。内皮细胞在支架表面上形成完整的单层。100mg/ml PDO支架的结果最佳，其在第3天具有大量的附着细胞，在第7天细胞数量增加。140mg/mlPDO支架在第3天显示具有大量的附着细胞，但到第7天时，细胞的增加量不如100mg/ml支架明显。
实例14.hUTC对HUVEC增殖和迁移的影响
该实例涉及用人脐带组织源细胞(hUTC)制备组织工程血管移植物(TEBV)。TEBV可以通过用人内皮细胞(EC)和人平滑肌细胞(SMC)接种血管移植物或支架材料而形成。设想hUTC将会增强血管移植物上EC和SMC的接种、附着和增殖。hUTC还可以促进EC或SMC或祖细胞在移植物构造体中的分化。这可促进TEBV在体外培养期间的成熟以及体内移植期间的移植物移入。hUTC可提供营养支持，或提供和增强ECM蛋白质的表达。
为了证明原理，在体外研究了hUTC对HUVEC的增殖和迁移的影响。为了研究增殖，测试了hUTC(批号120304)的影响，将来自不同血管床的三种内皮细胞用作应答细胞(人脐带静脉内皮细胞[HUVEC]、人冠状动脉内皮细胞[HCAEC]和人髂动脉内皮细胞[HIAEC])。含有hUTC的共培养物可增强内皮细胞的增殖。含有间质干细胞(MSC)或成纤维细胞的共培养物可使细胞数量与培养基对照相当(表1)。
通过计算转移transwell板底面上的细胞数量测定迁移量，将HUVEC和HCAEC均用作应答细胞。与研究增殖时不同，这些细胞的迁移应答稍有不同。HUTC(批号120304)引发了HUVEC和HCAEC的迁移。MSC未引发HUVEC的迁移，表明了对hUTC应答的特异性(表2)。
Figure BPA00001287225200301
表1.hUTC(批号120304)、MSC和成纤维细胞对内皮细胞增殖的影响。在共培养基(Hayflick 80％+EGM-2MV 20％或Hayflick 50％+EGM-2MV 50％)中，将内皮细胞(人脐带静脉内皮细胞、人髂动脉内皮细胞、人冠状动脉内皮细胞)接种到24孔组织培养皿的底部，密度为5000个细胞/cm2(10,000个细胞/孔)，并将hUTC(批号120304)、MSC或成纤维细胞接种到transwell板插入皿(insert)内，密度为5000个细胞/cm2(1,650个细胞/插入皿)。进行7天的共培养之后，采集细胞并用Guava仪计数。将内皮细胞保存在EGM-2MV培养基中，用作阳性对照。
Figure BPA00001287225200302
表2.hUTC和MSC对内皮细胞迁移的影响。在共培养基(Hayflick 50％+EGM-2MV 50％)中，将HUVEC或HCAEC接种到转移transwell板插入皿里内，密度为5000个细胞/cm2(23,000个细胞/插入皿)，并将hUTC(批号120304)或MSC接种到6孔组织培养皿的底部，密度为5000个细胞/cm2(48,000个细胞/孔)。进行7天的共培养后，采集转移transwell板插入皿底面上的细胞，并用Guava仪计数。将内皮细胞保存在EGM-2MV培养基中，用作对照。
实例15.细胞裂解液增强的活检穿孔的制备
在该实例中，通过重复的冻-融循环进行hUTC的培养扩增、采集、裂解，将其施加到实例1-11的可生物吸收支架上并冻干。细胞裂解液增强的支架可以直接移植，也可以接种细胞(如实例16、17所述)或组织糜(实例25)并进行培养，以形成组织工程血管。
在T225cm2细胞培养瓶(CORNING，Cat No 431082，Corning，NY)中，以5,000个细胞每平方厘米的密度用完全培养基培养脐带产后细胞hUTC(11代，批次120304)，该完全培养基为：低糖DMEM(GIBCO，目录号11054，Invitrogen，Carlsbad，CA)、15％胎牛血清(HyClone，目录号SH30070-03，Logan，UT)和青霉素链霉素溶液(GIBCO，目录号15070)。细胞扩增至大约25,000个细胞/cm2后，用TrypLE Select(GIBCO，目录号12563)采集细胞，并收集到50ml锥形管中，以300rcf离心5分钟，去除上清液。用PBS将细胞沉淀颗粒洗涤3次，然后重新悬浮于PBS中，浓度为1×107个细胞/ml，总体积为14ml。在液氮中速冻该溶液，然后在37℃的水浴中解冻，通过离心去除细胞碎片，取出所得的上清液(10ml)并储存。如上所述将剩余的材料再次骤冷、解冻和离心。取出上清液(2ml)并储存。通过用Bradford蛋白质检测定剂盒(BIO-RAD LaboratoriesHercules，CA)测定稀释于PBS中的样品，从而确定两种上清液的蛋白质浓度。第一裂解上清液(批号082908)的浓度为5.2mg/ml(批号082908，低浓度)，第二裂解上清液为18mg/ml(批号082908，高浓度)。
从PDO-ESS片状支架(实例3)上取下直径为5mm的活检穿孔。将这些支架放置于96孔超低簇板(COSTAR，目录号3474，Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)中，将25微升细胞裂解液加到每个培养皿上，其蛋白质浓度为5.2mg/ml(低浓度)或18mg/ml(高浓度)。然后将支架穿孔冻干48小时，以去除水分。
细胞附着：将细胞裂解液增强的支架放置于96孔低簇板中，并用25微升EGM-2培养基(Lonza Walkersville，MD)进行再水化。将人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)进行胰蛋白酶处理，计数并重新悬浮，使浓度为500,000个细胞/ml。在每个支架上接种100微升的该细胞悬浮液(50,000个细胞)，并让细胞在37℃下附着3小时。在该附着期后，将支架转移到含1ml EGM-2培养基的24孔低簇板中。将支架培养3天和7天。
在第3天和第7天，用活/死细胞染色法分析接种后支架的细胞附着，并用CyQuant检测法(Invitrogen)分析细胞数量，以测定细胞的DNA。进行活/死细胞染色时，将支架转移到含1ml无血清DMEM的新低簇24孔培养皿中。然后用另外的1ml无血清DMEM洗涤支架。制备包含2微摩尔钙黄绿素AM和4微摩尔乙锭均二聚物的活/死细胞染色储液，并在每个孔中加入0.5ml该溶液。在室温下孵育5分钟后，用荧光显微镜法评价细胞附着和生活力。
测定细胞的DNA时，用PBS洗涤支架，然后在微量离心管中用150微升PBS冷冻。然后将支架冻干至干燥，并重新悬浮于150微升木瓜蛋白酶消化溶液中。然后在60℃下将样品过夜消化。第二天，用CyQuant NF检测试剂盒(Invitrogen)测定10微升样品的DNA含量。
结果：在接种后第3天和第7天观察到，两种浓度的测试细胞裂解液的细胞数量均有所增加。通过活/死细胞染色，显示出在两个观察时间点细胞数量均较多而且均有较多的支架表面被涂覆(图4)。第3天后，与对照支架相比，细胞DNA增加了大约4倍(图5)。
实例16.管状支架上细胞裂解液的制备
将PDO管状支架(实例1，部分2)在蛋白质浓度为5.2mg/ml(批号082908，低浓度)的hUTC裂解溶液(实例15)中浸涂5分钟，然后用冻干机DURA-STOP(FTS system)冻干24小时。将冻干机通电，并将搁板室维持在-40℃，保持大约15分钟。连接用于监控搁板温度的热电偶，以便进行监控。将支架管置于维持在-40℃(预冷却)的冻干机中。启动冻干循环，将搁板温度在-40℃下保持15分钟，然后在-37℃下保持60分钟。抽真空。将搁板温度维持在-40℃，在该温度下保持180分钟。将搁板温度升至-25℃，并保持500分钟。将搁板温度升至-15℃，并保持180分钟。将搁板温度升至-5℃，并保持180分钟。将搁板温度升至5℃，并保持120分钟。将搁板温度在20℃下保持120分钟。将搁板温度在-20℃下保持120分钟。冻干后，对管状支架的细胞附着进行评估。
将各个管状支架放置于100mm的未处理板(得自Corning，目录号430591)中。将大鼠平滑肌细胞静态接种到涂覆有hUTC细胞裂解液或磷酸盐缓冲盐水(PBS)(作为对照)的管状支架上，接种密度为5×106个细胞/支架。将接种细胞的支架在37℃的潮湿空气中培养一小时，然后在培养皿中再加入15ml平滑肌培养基。将支架培养24小时。24小时后，用活/死细胞染色试剂盒(得自Invitrogen，目录号L3224)对支架进行评估。对涂覆有PBS或hUTC细胞裂解液并用大鼠SMC培养24小时的管状支架进行活/死细胞染色，结果显示有更多的细胞附着到涂覆有细胞裂解液的支架上(图6)。
实例17.细胞裂解液处理过的PDO片上的细胞片层的生成
该实例将证明接种在用细胞裂解液处理过的PDO片上的hUTC可以附着到支架上、在支架中迁移并可以渗透到支架中。这些片层可加工成管状结构，使得TEBV仅包含hUTC(参见下一个实例)，以便将其立刻移植入体内受伤脉管部位或在生物反应器中进行培养使其进一步成熟。将PDO片(2.0cm×2.0cm×0.01μm)(批号3904-78)(实例3)用40μl细胞裂解液(蛋白质总量为5.2mg/ml，批号082908)浸泡，然后在4℃下风干过夜。然后如实例15所述，在处理过的支架上接种hUTC，并进行培养和采集，接种密度为1.75×105个细胞/cm2。然后在与实例15所述细胞相同的条件下培养接种细胞的支架。在接种后第11天和第14天，固定细胞片层，以进行H&E染色。如图所示，尽管细胞只接种在一个面上，但细胞会散布在支架的整个表面以及支架内部，这表明hUTC在经细胞裂解液处理过的PDO支架内附着、迁移并增殖(图7)。
实例18.具有hUTC细胞和hUTC细胞裂解液的卷制ESS片的组织工程 移植物
在如实例3所述制备的两份PDO片(2×5×0.05cm，批号5-6-08-2片3904-50-3)上加载700μl PBS或hUTC细胞裂解液(蛋白质总量为5.2mg/ml，批号082908，低浓度)，并通过在-20℃下储存3天进行干燥。用350μl培养基(DMEM中的15％FBS)将每个片进行水化。如实例15所述获得350μl hUTC(5×106个细胞/ml)，并以1.75×105个细胞/cm2(细胞批号120304，P.9)的密度加载。在培养基中培养加载了细胞的片。在第4天，将每个片切成两部分(2×2.5×0.05cm)。将一部分卷成直径为5mm、长度为2.5mm的单层管，另一部分保持片状。
将纤维蛋白密封剂(0.5ml)(Omrix，Biopharmaceutices LTD，Tel Aviv Israel)涂覆到卷制PDO ESS片的边缘上，然后用凝血酶(0.5ml)(Omrix，Biopharmaceutices LTD，Tel Aviv Israel)将支架的末端相互粘合，使支架保持管状。从轴柄上取下粘合的卷制管。另一个片保持片状。继续在37℃下培养所有的管和片。在培养后第1天和第4天，评估管和片中hUTC的生活力、附着和增殖。结果显示，hUTC通过附着和生长汇合在含有或不含细胞裂解液的PDO片上。在用细胞裂解液处理过的PDO片上，细胞附着较强。尽管在卷制过程中，PDO片上形成的细胞层受到干扰，因此在形成管后第1天进行评估时细胞密度较低，但最后hUTC均匀并且密集地分布在管的整个腔表面上，而且发现用hUTC细胞裂解液处理过的PDO材料有更多的增殖(图8)。
实例19.具有rSMC细胞和hUTC细胞裂解液的卷制ESS片的组织工程 移植物
在实例3所述的PDO片(2×2.5×0.005cm，批号3904-72-23)上加载60μl hUTC细胞裂解液(蛋白质总量为5.2mg/ml，批号082908，低浓度)。将大约250μl rSMC(Cell Applications，San Diego，CA)(浓度为3.75×106个细胞/ml)接种到PDO片上，接种密度为1.75×105个细胞/cm2。在37℃下保存2小时后，将接种的材料浸入SMC培养基(GM)。培养5天后，将片围绕轴柄(φ＝2mm)卷成管(约4层)。
用实验室用机器将ESS片卷成可用于形成组织工程血管的移植物。机器上带有夹具，将轴柄连接到夹具上，旋转夹具将片卷成管。将培养有细胞的PDO ESS片放置于轴柄(直径为5mm，或直径为2mm)上。通过缓慢旋转轴柄形成5层的含细胞支架。如实例17所述用纤维蛋白密封剂将管进行密封。将该构造体置于GM中培养5天，然后转移至SMC分化培养基(DM)中再培养4天。将该构造体切成2段，一段用于活/死细胞染色，另一段用于通过固定到10％的福尔马林缓冲液中进行H&E染色。
结果显示，rSMC细胞从支架的两个面渗透到支架中，并在支架的整个材料厚度内良好地附着和增殖。一些区域(右板)显示出两层整合在一起(图9)。
实例20.在直径2mm的组织工程血管支架上接种hUTC
该实例涉及将人脐带细胞(hUTC)均匀接种到不同内径的PDO-ESS管中，然后进行培养以使细胞生长并形成基质。这种生长可包括在生物反应器中的静态培养或生理条件下的培养，例如具有或没有压力和/或脉动流的腔内流动。可以先在PDO-ESS管上涂覆I型胶原或其他细胞外基质组分。
通过将长度为大约3.5cm、内径为2mm的PDO-ESS管(100mg/ml，实例1，部分2)浸入50微克/毫升鼠尾I型胶原溶液(BD Biosciences，Bedford，MA)中，从而在管上涂覆胶原。用丝线将涂覆有胶原的管和未涂覆的对照固定到LumeGen生物反应器室(Tissue Growth Technologies，Minnetonka MN)内的倒钩上，并将室密封。外部腔室充满完全培养基，管状支架浸入培养基中。将hUTC进行胰蛋白酶处理，计数并以5.5×105个细胞/ml的浓度重新悬浮于完全培养基中。然后将接种环与LumeGen室连接。当放置于标准组织培养转瓶上时，这些环允许室旋转。用注射器将细胞悬浮液注入PDO-ESS管的内腔中，并消除所有气泡。将腔室末端密封，并将该室放置于转瓶上，在37℃下以大约0.4rpm的旋转速率培养过夜。过夜培养后，将管剪开，取5mm的活检穿孔，检查细胞在TEBV支架内的分布。将支架的活检切片转移到含1ml PBS的新低簇24孔培养皿中。制备包含2微摩尔钙黄绿素AM和4微摩尔乙锭均二聚物的活/死细胞染色储液，并在每个孔中加入0.5ml该溶液。然后将支架穿孔转移到含活/死细胞染色溶液的孔中。在室温下孵育5分钟后，用荧光显微镜法评价细胞附着和生活力。
结果：在接种hUTC的PDO-ESS管上观察到大量细胞附着。与未涂覆的PDO-ESS管相比，附着到涂覆有胶原的PDO-ESS管上的细胞数量明显增加。在每个样品中观察到的死亡细胞极少(图10)。
实例21.用于形成组织工程血管的生物反应器处理(静态培养)
该实例涉及将平滑肌细胞均匀接种到不同内径的PDO-ESS管中，然后进行培养使细胞生长和基质形成。这种生长可包括在生物反应器中的静态培养或生理条件下的培养，例如具有或没有压力和/或脉动流的腔内流动。
用丝线将长度大约为5cm的PDO-ESS管(100mg/ml)或PDO/胶原-ESS管(实例1部分2和实例2部分2)固定到LumeGen生物反应器室(TissueGrowth Technologies，Minnetonka MN)内的倒钩上。将室密封后，外部腔室中充满平滑肌培养基(Cell Applications，Inc.，San Diego，CA)，管状支架浸入培养基中。将大鼠主动脉平滑肌细胞(Cell Applications，Inc.)进行胰蛋白酶处理，计数并以2×106个细胞/ml的浓度重新悬浮于培养基中。然后将接种环与LumeGen室连接。当放置于标准组织培养转瓶上时，这些环允许室旋转。用注射器将细胞悬浮液注入PDO-ESS管的内腔中。将腔室末端密封，并将该室放置于转瓶上，在37℃下以大约0.4rpm的旋转速率培养过夜。过夜培养后，将部分管剪开，取5mm的活检穿孔，检查细胞在TEBV支架内的分布。将支架的活检切片转移到含1ml无血清DMEM的新低簇24孔培养皿中。然后用另外的1ml无血清DMEM洗涤支架。制备包含2微摩尔钙黄绿素AM和4微摩尔乙锭均二聚物的活/死细胞染色储液，并在每个孔中加入0.5ml该溶液。在室温下孵育5分钟后，用荧光显微镜法评价细胞附着和生活力。
然后将LumeGen室中接种细胞的PDO-ESS支架连接到能够产生生理流速、脉动流和压力的LumeGen生物反应器上。脉动流部分来自蠕动泵，而压力和脉冲可以通过挤压来自内腔或室的出口介质流管路进行调节。此外，可以任选地通过以脉动方式压缩移植物的机构增加脉动。这可以通过计算机界面进行控制。流体开始流动，将细胞暴露于10ml/min的流速下2小时。该流动期之后，从室内取出一个TEBV支架，如上所述用活/死细胞染色进行分析。然后将另一个接种细胞的PDO-ESS支架在LumeGen室内静态培养7天，然后如上所述用活/死细胞染色进行分析。
结果：活/死细胞染色结果显示，LumeGen室内的旋转接种方法能使细胞在PDO-ESS支架上附着并均匀地分布在支架的整个长度方向上(图11)。此外，将细胞暴露于10ml/min的流体下不会使细胞从支架的腔表面上脱落。暴露于流体后将接种的支架孵育7天可以使细胞数量增加，而不会影响细胞的生活力(图12)。
实例22.用于形成组织工程血管的生物反应器处理(脉动流生理条件- 短期培养)
该实例涉及将平滑肌细胞均匀接种到不同内径的PDO-ESS管上，然后在动态条件下进行培养，以使细胞生长和基质形成。这些动态条件可包括在生物反应器中的生理或非生理条件下培养，例如具有或没有压力的腔内流和/或脉动流。此外，可以将流体引入外部腔室，从而将组织工程血管构造体的外部浸入培养基中。
用丝线将长度为大约5cm、直径为4mm的PDO-ESS管(100mg/ml，实例1部分2)固定到LumeGen生物反应器室(Tissue Growth Technologies，Minnetonka MN)内的倒钩上，并将室密封。外部腔室中充满平滑肌培养基(Cell Applications，Inc)，管状支架浸入培养基中。将大鼠主动脉平滑肌细胞(Cell Applications，Inc.)进行胰蛋白酶处理，计数并以2×106个细胞/ml的浓度重新悬浮于培养基中。然后将接种环与LumeGen室连接。当放置于标准组织培养转瓶上时，这些环允许室旋转。用注射器将细胞悬浮液注入PDO-ESS管的内腔中。将腔室末端密封，并将该室放置于转瓶上，在37℃下以大约0.4rpm的旋转速率培养过夜。
然后将LumeGen室中一个接种有细胞的PDO-ESS支架连接到能够产生生理流动条件(包括脉动流和压力)的LumeGen生物反应器上。脉动流部分来自蠕动泵，而压力和脉冲可以通过挤压来自内腔或室的出口介质流管路进行调节。此外，可以通过以脉动方式压缩移植物的机构增加脉动。这可以通过计算机界面进行控制。流体开始流动，并将接种到管状支架上的细胞暴露于20ml/min的流速和120-80mm Hg、频率为1Hz的脉动压力下。作为对照，将生物反应器室内的另一个接种细胞的管进行静态培养，24小时后更换腔内培养基。
培养三天后，从室内移出管状支架，剪开，取5mm的活检穿孔，检查TEBV支架内的细胞数量、分布和形态。将支架的活检穿孔转移到含1mlPBS的新低簇24孔培养皿中。制备包含2微摩尔钙黄绿素AM和4微摩尔乙锭均二聚物的活/死细胞染色储液，并在每个孔中加入0.5ml该溶液。然后将支架穿孔转移到含活/死细胞染色溶液的孔中。在室温下孵育5分钟后，用荧光显微镜法评价细胞附着和生活力。
结果：活/死细胞染色结果显示，LumeGen室内的旋转接种方法能使细胞在PDO-ESS支架上附着并均匀地分布在支架的整个长度方向上。另外，将细胞暴露于20ml/min的流体和120-80mm Hg的生理脉动压力下可以显著增加支架表面上的细胞数量。此外，细胞的形态变为在流动方向上进行排列(图13)。
实例23.用于形成接种有细胞的组织工程血管的生物反应器处理(脉动 流生理条件-长期培养)
在灌注式旋转壁脉管生物反应器(Synthecon，Inc.，Houston TX)中将细胞(脐带动脉平滑肌细胞-UASMC)接种到如实例1-11所述的支架上。生物反应器具有中央旋转芯，芯上带有可以连接支架的倒钩。该芯允许通过支架的内腔灌注培养基，而外部浸在培养基中。如上所述水平旋转整个组件，再次最小化剪切应力。在细胞接种到支架的腔表面上时，将细胞悬浮液(106个细胞/ml)送入支架的内腔中。停止流动，并继续旋转。生物反应器旋转时，细胞均匀地附着到旋转内腔的表面上。通过2至4小时的培养期进行附着后，将剩余的未附着细胞从内腔中冲洗掉，然后通过内腔灌注培养基。该培养周期持续约14天，以使细胞生长并迁移到支架的孔中(凭经验确定实际培养时间)。
用若丹明-鬼笔环肽进行钙黄绿素染色和/或肌动蛋白染色后，通过共焦显微镜法检查细胞在支架内的生长。用类似技术确定细胞生长的深度和/或在支架生物材料中的迁移。观察横截面图像，并用图像分析工具测定细胞向内生长的深度。
其他接种细胞的支架可转移到能够产生生理流速、脉动流和压力的第二生物反应器(Tissue Growth Technologies，Inc.)中。脉动流部分来自蠕动泵，而压力和脉冲可以通过挤压来自内腔或室的出口介质流管路进行调节。此外，可以通过以脉动方式压缩移植物的机构增加脉动。这可以通过计算机界面进行控制。生物反应器具有内置的压力传感器，以及可测量移植物外径的激光测微器。在计算机上对流速、压力和移植物外径进行实时作图。这样让使用者可以向移植物施加生理压力和脉动波，并以任何方式改变它们。
根据所需的物理和生物特性，将接种细胞的移植物在该生物反应器中再培养一段时间。在第一时间段内，缓慢提高压力和流速，直到最终达到所需的生理水平。最终参数取决于支架的最终位置。在最后阶段期间保持上述水平。每天记录1小时的以下测量值：生物反应器室内的压力波动；流速；以及支架外径的波动。在培养期结束时，可加大压力直至移植物失效，以确定构造体的耐破强度。
实例24.用于形成细胞片层组织工程血管的生物反应器处理
将如实例17-18中所述卷成管的细胞片层可以采用生物反应器处理进行进一步的生物处理，以形成组织工程血管。在灌注式旋转壁脉管生物反应器(Synthecon，Inc.)中将细胞(hUTC或IMA)接种到细胞片层上。生物反应器具有中央旋转芯，芯上带有可以连接支架的倒钩。该芯允许通过支架的内腔灌注培养基，而外部浸在培养基中。如上所述水平旋转整个组件，再次最小化剪切应力。在细胞接种到支架的腔表面上时，将细胞悬浮液(106个细胞/ml)送入支架的内腔中。停止流动，并继续旋转。生物反应器旋转时，细胞均匀地附着到旋转内腔的表面上。通过2至4小时的培养期进行附着后，将剩余的未附着细胞从内腔中冲洗掉，然后通过内腔灌注培养基。该培养周期持续约14天，以使细胞生长并迁移到支架的孔中(凭经验确定实际培养时间)。
用若丹明-鬼笔环肽进行钙黄绿素染色和/或肌动蛋白染色后，通过共焦显微镜法检查细胞在支架内的生长。用类似技术确定细胞生长的深度和/或在支架生物材料中的迁移。观察横截面图像，并用图像分析工具测定细胞向内生长的深度。
接种细胞的支架可转移到能够产生生理流速、脉动流和压力的第二生物反应器(Tissue Growth Technologies，Inc.)中。脉动流部分来自蠕动泵，而压力和脉冲可以通过挤压来自内腔或室的出口介质流管路进行调节。此外，可以通过以脉动方式压缩移植物的机构增加脉动。这可以通过计算机界面进行控制。生物反应器具有内置的压力传感器，以及可测量移植物外径的激光测微器。在计算机上对流速、压力和移植物外径进行实时作图。这样让使用者可以向移植物施加生理压力和脉动波，并以任何方式改变它们。
根据所需的物理和生物特性，将接种细胞的移植物在该生物反应器中再培养一段时间。在第一时间段内，缓慢提高压力和流速，直到最终达到所需的生理水平。最终参数取决于支架的最终位置。在最后阶段期间保持上述水平。每天记录1小时的以下测量值：生物反应器室内的压力波动；流速；以及支架外径的波动。在培养期结束时，可加大压力直至移植物失效，以确定构造体的耐破强度。
实例25.管状构造体上的组织糜的制备
用直径为5mm的活检穿孔器(Miltex，REF No 33-35)从大鼠肌(Lewis大鼠，得自Harlan，Indianapolis，IN)上采集两个小活检组织切片。将重量为大约50-60mg的每个活检切片放入加有标准浓度青霉素(100U/ml)的PBS中。将组织在PBS中冲洗三次，并切碎成小块。将组织糜称重，并分成25mg和50mg，然后均匀地分散在每个管状构造体的外表面上(图14)。用纤维蛋白胶(EVICEL，目录号3905，Ethicon，Somerville，NJ)将组织片段固定在支架上。在管状构造上装入组织糜并放置于培养箱中，在37℃下培养2小时和72小时(图15)。
实例26.具有两种来源的组织糜的组织糜接种TEBV构造体的制备
该实例描述了由接种自体组织糜的可生物吸收支架形成的组织工程血管，其中自体组织糜作为细胞来源。制备如实例1-11所述尺寸的管状或扁平的可生物吸收支架。采集包含平滑肌细胞的小组织活检切片，其中平滑肌细胞来自于组织源，如中空器官壁中的肌肉层(如消化道、食道下部、胃和肠、膀胱壁、子宫、多种腺体管道以及血管壁)。将活检组织放入加有标准浓度青霉素(100U/ml)的PBS中。将组织在PBS中冲洗三次，然后用解剖刀切碎，获得组织糜。然后将组织均匀分散在管状或扁平构造体的外表面上。从内皮组织来源获得另一个组织活检切片，如血管内层。将组织放入加有标准浓度青霉素(100U/ml)的PBS中。将组织切碎并分散在管状构造体的内表面或扁平构造体的内表面上。然后用适于细胞的胶(如纤维蛋白胶)将两种组织碎片固定在支架上。现在可以将扁平支架构造体缝合成管状构造体。然后该构造体可以在低细胞附着培养皿中，用含有青霉素链霉素溶液和15％FBS的DMEM培养基培养4至8周，在这期间平滑肌细胞和内皮细胞将从组织糜迁移到支架上。然后工程血管可以在生物反应器中的DMEM中，在10％CO2的气氛和37℃的温度下进一步培养若干周或若干月，其中DMEM中加有20％FBS、青霉素G(100U/ml)、5mM HEPES、抗坏血酸(0.05mg/ml)、CuSO4(3ng/ml)、脯氨酸(0.05mg/ml)、丙氨酸(0.03mg/ml)和甘氨酸(0.05mg/ml)，如实例27所述。
实例27.具有单一来源的组织糜的组织糜接种TEBV构造体的制备
在另一个实例中，接种有组织糜的构造体可以如实例25所述进行制备。然而，组织糜的来源可以是单一来源，使得单一组织来源包含平滑肌细胞和内皮细胞，并将该组织糜碎片施加到支架的内外表面上。
实例28.用于形成细胞裂解液或组织糜工程血管的生物反应器处理
具有如实例1-11、24-26所述的组织糜或细胞裂解液和支架的构造体可以采用生物反应器处理进行进一步的生物处理，以形成组织工程血管。在灌注式旋转壁脉管生物反应器(Synthecon，Inc.，Houston TX)中将细胞(如hUTC或IMA)接种到具有组织糜和支架的构造体上。生物反应器具有中央旋转芯，芯上带有可以连接支架的倒钩。该芯允许通过支架的内腔灌注培养基，而外部浸在培养基中。如上所述水平旋转整个组件，再次最小化剪切应力。为了将细胞接种到具有组织糜和支架的构造体的腔表面上，将细胞悬浮液(106个细胞/ml)泵送至构造体的内腔中。停止流动，并继续旋转。生物反应器旋转时，细胞均匀地附着到旋转内腔的表面上。通过2至4小时的培养期进行附着后，将剩余的未附着细胞从内腔中冲洗掉，然后通过内腔灌注培养基。该培养周期持续约14天，以使细胞生长并迁移到支架的孔中(凭经验确定实际培养时间)。
用若丹明-鬼笔环肽进行钙黄绿素染色和/或肌动蛋白染色后，通过共焦显微镜法检查细胞在支架内的生长。用类似技术确定细胞生长的深度和/或在支架生物材料中的迁移。观察横截面图像，并用图像分析工具测定细胞向内生长的深度。
接种细胞的支架可转移到能够产生生理流速、脉动流和压力的第二生物反应器(Tissue Growth Technologies，Inc.)中。脉动流部分来自蠕动泵，而压力和脉冲可以通过挤压来自内腔或室的出口介质流管路进行调节。此外，可以通过以脉动方式压缩移植物的机构增加脉动。这可以通过计算机界面进行控制。生物反应器具有内置的压力传感器，以及可测量移植物外径的激光测微器。在计算机上对流速、压力和移植物外径进行实时作图。这样让使用者可以向移植物施加生理压力和脉动波，并以任何方式改变它们。
将接种有细胞的移植物在该生物反应器中再培养7天。在最初的3天内，缓慢提高压力和流速，直到最终达到所需的生理水平。最终参数取决于支架的最终位置。在最后的4天内保持以上水平。每天记录1小时的以下测量值：生物反应器室内的压力波动；流速；以及支架外径的波动。在培养期结束时，可加大压力直至移植物失效，以确定构造体的耐破强度。
实例29.TEBV的体内功效研究
通过手术将TEBV移植到14只成年狗的股动脉中。切除5至10mm的部分原生血管，并用标准外科手术技术将其更换为试验TEBV。用标准缝合技术进行缝合。用标准肝素溶液冲洗管内腔。用标准技术缝合肌肉和皮肤。手术后，用标准超声波监控通畅性。
4周后移出TEBV，并通过直接检查评估通畅性。通过切开TEBV确定通畅性，并对内腔进行组织学评估。
实例30.用TEBV对冠心病患者进行治疗
在冠状动脉旁路(CABG)手术中，用TEBV对患有动脉硬化的患者进行治疗，动脉硬化是一种表征为动脉壁增厚(阻塞)、失去弹性以及钙化的常见动脉疾病。动脉硬化会导致血液供应量减少，从而损坏心脏，导致中风和心脏病发作。
因此，通过如实例1所述的静电纺丝方法制备PDO管状支架，然后如实例10所述进行细胞接种和生物反应器处理，形成TEBV，然后进行消毒、包装并送到手术室中。在典型的CABG手术中，外科医生通过胸骨切开术打开胸腔。心脏功能由心肺机替代。找到病变动脉，将TEBV的一端缝合到冠状动脉上，越过阻塞处，将另一端连接到主动脉上。让心脏恢复跳动，将胸骨连接在一起，并缝合切口。成功完成旁路手术后，几周内患者可完全痊愈，并且身体机能恢复正常。
以上描述仅为示例性的，不应理解为在决定设计和材料取向的优化时已考虑到所有方面。尽管所示和所述的据信是最为实用和优选的实施例，但显然，对所述和所示的具体设计和方法的变更对本领域中的技术人员来说显而易见，并且可在不脱离本发明精神和范围的情况下使用这些变更形式。本发明并非局限于所述和所示的具体实施例，而应该理解为与落入所附权利要求书的范围内的所有修改形式相符。
实例31.乳内动脉源细胞：分离和表征
乳内动脉源细胞的分离
从美国疾病研究交流中心(National Disease Research Interchange，NDRI，Philadelphia，PA)获得乳内动脉(IMA)。为了去除血液和残骸，要对动脉进行修整并在达尔伯克氏改良伊格尔培养基(低糖DMEM；Invitrogen，Carlsbad，CA)或磷酸盐缓冲盐水(PBS；Invitrogen)中洗涤。然后在组织培养板中将动脉进行机械离解直至组织碎成精浆。然后将组织转移到50毫升的锥形管中。然后将组织放入含0.25单位/毫升胶原酶(Serva Electrophoresis，Heidelberg，Germany)、2.5单位/毫升分散酶(Roche Diagnostics Corporation，Indianapolis IN)和1单位/毫升透明质酸酶(Vitrase，ISTA Pharmaceuticals，Irvine，CA)的酶混合物中进行消化。然后将酶混合物与含1％胎牛血清(FBS)的培养基(低糖DMEM(Gibco)、青霉素(50单位/毫升)和链霉素(50ug/mL，Gibco))混合。将装有组织、培养基和消化酶的锥形管在37℃、225rpm的轨道式震荡器中培养2小时。
将消化物离心(150×g)5分钟，然后吸出上清液。然后将沉淀颗粒重新悬浮于20微升的培养基中。然后通过一个40微米尼龙BD FALCON细胞滤器(BD Biosciences，San Jose，CA)过滤细胞悬液。然后将滤液重新悬浮于培养基(总体积为50毫升)中，并离心(150×g)5分钟。然后吸出上清液，并将细胞重新悬浮于另外的50毫升新鲜培养基中。再将该洗涤工序重复两次。
最后一次离心后，将细胞接种至含有1％FBS或10％FBS的培养基中，在37℃和5％CO2下进行培养。也可以在带涂层或未带涂层的组织培养瓶中将IMA碎片作为外植体培养。用胰蛋白酶或其他非酶方法采集在培养基选择条件下迁移出组织碎片的细胞。
为了进行核型分析，将第4代和第10代乳内动脉源细胞接种至T25培养瓶中，让其附着过夜。然后将培养瓶装满REGM，送至新泽西医科齿科大学(University of Medicine and Dentistry of New Jersey)进行核型分析。
生长潜力的分析
将5000个细胞/cm2的IMA源细胞接种至T75培养瓶的培养基中，于37℃和5％二氧化碳下进行培养。细胞每3-5天传代一次。用Guava仪(Guava Technologies，Hayward，CA)测定每一代的细胞数量以及生活力。然后计算群体倍增数[ln(最终细胞收率/细胞的初始接种数)/ln2]。
流式细胞术
对IMA源细胞进行流式细胞术分析。在37℃和5％二氧化碳下，将接种在T225培养瓶的培养基中的细胞扩增四代和十代。在PBS中洗涤附着的细胞，并用胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(Gibco)分离。收获细胞、离心并以1×107个细胞/mL的浓度重新悬浮于3％(v/v)FBS的PBS溶液中。将特异性抗体加入100微升的细胞悬浮液中，将混合物在黑暗环境中于4℃下孵育30-45分钟。孵育后，用PBS洗涤细胞，并离心以去除多余的抗体。然后将细胞重新悬浮于500微升PBS中，并通过流式细胞术进行分析。用Guava仪进行流式细胞术分析。使用的抗体示于表3中。
表3.用于鉴别IMA源细胞的细胞表面标记的抗体。
Figure BPA00001287225200441
总RNA的分离
从IMA源细胞中提取RNA(RNeasy小量提取试剂盒(RNeasy MiniKit)；Qiagen，Valencia，CA)。用50μL DEPC处理水洗脱RNA，并储存于-80℃下。
逆转录
用无规六聚体引物和TaqMan逆转录试剂(Applied Biosystems，FosterCity，CA)将RNA进行逆转录，在25℃下保持10分钟，在37℃下保持60分钟，在95℃下保持10分钟。将样品储存于-20℃下。用常规PCR研究所选基因(参见下表)。
PCR
用RT2PCR引物组(SuperArray Biosciences Corp，Frederick MD)对cDNA样品进行PCR反应(GAPDH除外-参见下面的图表)。对下面所示的所有引物进行序列验证。
 基因   目录号
 Oct 4   PPH02394A
 Rex 1   PPH02395A
 SOX2   PPH02471A
 人TERT(hTERT)   PPH00995A
 FGF4   PPH00356A
根据制造商的说明书，将引物与1μl cDNA和2X ReactionReadyTMSYBR Green PCR主混合物(SuperArray Biosciences)混合，并用ABI Prism7000系统(Applied Biosystems，Foster City，CA)进行PCR。热循环条件初始为50℃2分钟，95℃10分钟，然后是95℃15秒和60℃1分钟的34个循环。对于GAPDH，根据制造商的方案，用购自Applied Biosystems的GAPDH引物(目录号402869)、1μL cDNA溶液和1×AmpliTaq Gold通用混合PCR反应缓冲液(Applied Biosystems，Foster City，CA)进行PCR。最终PCR反应中的正向引物和反向引物的浓度均为0.5μM，不加TaqMan探针。将样品在2％(w/v)琼脂糖凝胶上进行电泳，并用溴化乙锭(Sigma，St.Louis，MO)染色。用667 Universal Twinpack膜(VWR International，South Plainfield，NJ)和焦距PolaroidTM照相机(VWR International，South Plainfield，NJ)采集图像。
ELISA
将第四代和第十代IMA源细胞解冻，并将其接种到T75培养瓶上，浓度为5000个细胞/cm2，每个培养瓶中装有15毫升培养基。然后将细胞在5％二氧化碳和大气氧中于37℃下培养24小时。将培养基换成无血清培养基(低糖DMEM(Gibco)，0.1％(w/v)牛血清白蛋白(Sigma)，青霉素(50单位/毫升)和链霉素(50ug/mL，Gibco))，并继续培养8小时。在培养结束时通过离心(14,000×g)5分钟收集调理过的无血清培养基，并储存于-20℃下。
为了评估每个培养瓶中的细胞数量，用PBS洗涤细胞，再用2毫升胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(Gibco)分离，然后用Guava仪(Guava TechnologiesHayward，CA)计数。然后使用Searchlight蛋白质组阵列(Searchlight ProteomeArrays，Pierce Biotechnology Inc.)对样品进行以下因子的分析：金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP1)、金属蛋白酶组织抑制剂-2(TIMP2)、血小板源性上皮生长因子bb(PDGFbb)、角质细胞生长因子(KGF)、肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、肝素结合性表皮生长因子(HB-EGF)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP1)、白介素-6(IL6)、白介素-8(IL8)、转化生长因子-α(TGFa)、脑源性神经营养因子(BDNF)、基质衍生因子1B(SDF1B)、睫状神经营养因子(CNTF)、碱性神经生长因子(bNGF)、神经营养因子-3(NT3)。
实例32.将大鼠平滑肌细胞R354-05接种进PDO支架中
该实例涉及将大鼠平滑肌细胞R354-05(Cell Applications)均匀地静态接种到PDO-ESS管中(实例1，部分2)。培养细胞，以使细胞能生长并形成基质。这种生长可包括在生物反应器中的静态培养或生理条件下的培养，例如具有或没有压力和/或脉动流的腔内流动。
将PDO管切成2cm的长度，并置于60mm组织培养皿中。将大鼠主动脉平滑肌细胞(Cell Applications，Inc.)进行胰蛋白酶处理，计数并以2×106个细胞/ml的浓度重新悬浮于大鼠平滑肌培养基中。用200ul吸移管的顶端将细胞慢慢滴到PDO管上。将装有细胞的PDO管在室温下放置一小时，然后在37℃的潮湿环境中放置4天。
静态培养四天后，将PDO管在旋转速率为7.0rpm的旋转细胞培养系统(Synthecon)中放置十天，以便让细胞生长并形成基质。在培养的第14天，评估细胞的分布和形态。将PDO管转移到60mm组织培养皿中。采集5mm的活检穿孔，并将其放置于含PBS的24孔板中。通过活/死细胞染色分析(分子探针)测试细胞的生活力。制备十毫升含2微摩尔钙黄绿素AM和4微摩尔乙锭均二聚物的PBS。在活检切片上滴加一毫升活/死细胞染色溶液。在室温下孵育5分钟后，用荧光显微镜法评价细胞附着和生活力。将类似的穿孔活检在10％中性福尔马林缓冲液中固定，包埋于石蜡中，切片，并用H&E染色以评估细胞形态(图16)以及用Masson三色染色法染色，Masson三色染色法专用于检测细胞外基质的形成。
结果：大鼠平滑肌细胞在整个培养期均为存活状态，PDO管可支持细胞的生活力。将大鼠平滑肌细胞静态接种四天导致细胞均匀分布。细胞附着到支架的两面上。并且观察到细胞侵润至支架中。

Claims (9)

1.一种用于组织工程血管的管状构造体，所述构造体包括包含聚(对二氧杂环己酮)的支架和一种或多种细胞、细胞片层、细胞裂解液和组织糜，特征在于所述支架为通过静电纺丝制备的纺织物。
2.根据权利要求1所述的管状构造，其中所述支架还包含胶原。
3.根据权利要求1所述的管状构造，其中所述细胞选自内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、人脐带源细胞以及它们的组合。
4.一种用于制备组织工程血管的方法，所述方法包括以下步骤：
a.提供包含聚(对二氧杂环己酮)的管状支架；
b.在所述支架上接种一种或多种细胞，所述细胞选自内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞和人脐带源细胞；以及
c.在生物反应器中培养所述接种有细胞的支架，特征在于所述支架为通过静电纺丝制备的纺织物。
5.一种用于制备组织工程血管的方法，所述方法包括以下步骤：
a.提供包含聚(对二氧杂环己酮)的管状支架；
b.用人脐带源细胞片层包裹所述支架；以及
c.在生物反应器中培养所述包裹有细胞片层的支架，特征在于所述支架为通过静电纺丝制备的纺织物。
6.一种用于制备组织工程血管的方法，所述方法包括以下步骤：
a.提供包含聚(对二氧杂环己酮)的管状支架；
b.用肌肉组织糜和内皮组织糜涂敷所述支架；以及
c.在生物反应器中培养所述组织糜支架，特征在于所述支架为通过静电纺丝制备的纺织物。
7.一种用于制备组织工程血管的方法，所述方法包括以下步骤：
a.提供包含聚(对二氧杂环己酮)的管状支架；
b.用细胞裂解液涂敷所述支架；然后
c.将所述支架冻干，特征在于所述支架为通过静电纺丝制备的纺织物。
8.根据权利要求7所述的方法，所述方法还包括以下步骤：
a.将一种或多种细胞和组织糜涂敷至所述细胞裂解液支架上；以及
b.在生物反应器中培养所述具有一种或多种细胞和组织糜的细胞裂解液支架。
9.一种用于制备组织工程血管的方法，所述方法包括以下步骤：
a.提供包含聚(对二氧杂环己酮)的支架；
b.在所述支架片上接种细胞；
c.将所述接种的片卷成管；以及
d.在生物反应器中培养所述管，特征在于所述支架为通过静电纺丝制备的纺织物。
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