CN101538311A

CN101538311A - α-氨基酰环酰亚胺类肽金属蛋白酶抑制剂及其应用

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Publication number: CN101538311A
Application number: CN200910020656A
Authority: CN
Inventors: 徐文方; 李乾斌; 王学建; 方浩
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2009-04-16
Filing date: 2009-04-16
Publication date: 2009-09-23
Anticipated expiration: 2029-04-16
Also published as: CN101538311B

Abstract

α－氨基酰环酰亚胺类肽金属蛋白酶抑制剂及其应用。本发明提供了一类强效的类肽金属蛋白酶抑制剂，并且在内肽酶和外肽酶之间体现出显著的选择性，可有效治疗金属蛋白酶活性异常表达的疾病。具体而言，本发明涉及具有通式(I)结构的类肽化合物及其药学上可接受的盐。本发明还涉及含有式(I)结构类肽化合物的药物组合物及其制药用途。

Description

α-氨基酰环酰亚胺类肽金属蛋白酶抑制剂及其应用

技术领域

本发明涉及一类具有α-氨基酰环酰亚胺类肽骨架的金属蛋白酶抑制剂及其制备方法和用途，属于化学技术领域。

背景技术

1、基质金属蛋白酶(MMPs)

基质金属蛋白酶(MMPs)是一类依赖钙离子和锌离子的内肽酶，基质金属蛋白酶(MMPs)的活性由基因表达水平和酶原激活/抑制因子的分泌水平严格控制。基质金属蛋白酶(MMPs)在细胞外基质降解、组织重建过程中起重要作用。在很多病理过程，如关节炎、组织溃烂、恶性肿瘤的生长和转移中，基质金属蛋白酶(MMPs)也起到了重要作用。

目前在哺乳动物中发现了基质金属蛋白酶(MMPs)家族的28个成员(Szabo，K.A.et al.Clinical and Applied Immunology Reviews.2004，4，295)，根据其结构、特异性底物和不同的细胞位置，分为不同的亚型，包括种胶原酶(MMP-1，-8，-13，-18)，2种明胶酶(MMP-2，-9)，3种基质降解酶(MMP-3，-10，-11)，6种膜型-基质金属蛋白酶(MMP-14，-15，-16，-17，-24，-25)，以及其他未归类的如基质溶解素(MMP-7和-26)和巨噬细胞金属弹性蛋白(MMP-12)等。其中明胶酶(MMP-2和-9)已被证明于侵袭性肿瘤的恶性表型及癌症病人的不良预后密切相关，他们参与了肿瘤细胞对基底膜、基质的侵袭，对血管壁的穿透，以及肿瘤细胞的转移。近年来研究表明，基质金属蛋白酶(MMPs)还与原发瘤和继发瘤的生长、以及血管生成有关，甚至对肿瘤增值过程亦起促进作用。因此，瞄准以这些酶为作用靶点的治疗策略也迅速发展起来，基质金属蛋白酶(MMPs)抑制剂已成为癌症治疗药物研究中的热点。

可用基质金属蛋白酶(MMPs)抑制剂治疗的例子包括：类风湿性关节炎(Mullins，D.E.；etal.Biochim.Biophys.Acta.1983，695，117)；骨关节炎(Henderson，D.；et al.Drugs of the Future，1990，15，495)；癌症；肿瘤细胞转移(Deryugina，E.I.；et al.Cancer Metastasis Rev.2006，25，9)；多发性硬化症(Rosenberg，G.A.et al.Ann Neurol.2001，50，431)；以及各种组织溃疡或组织溃疡性病症。如发生在角膜的溃疡可能是因碱灼伤所致，或因感染铜绿假单孢军、Acanthamoeba、单纯性疱疹和牛痘病毒所致。

以金属蛋白酶活性过度为特征的病症的其他例子包括牙周病、大疱性表皮松懈症、发热、炎症和巩膜炎(Cf.Decicco，et al WO95/29892)。

2、氨肽酶N

氨肽酶N(APN/CD13)为依赖于锌离子的金属外肽酶，参与底物N端氨基酸的降解。正常条件下，APN在哺乳动物的肾脏、小肠以及中枢神经系统等组织中广泛低水平表达，参与机体的生理调节。研究证明，氨肽酶N在肿瘤发生、免疫功能调节以及病毒感染中发挥重要的作用。1)APN在肿瘤细胞表面高水平表达。该酶可使细胞外基质(ECM)的主要成分降解，破坏了机体的天然屏障，促进肿瘤细胞的侵袭、生长和转移，参与肿瘤新血管生成。(Saiki，I.；et al.Iht.J.Cancer.，1993，54，137；Sato，Y.Biol.Pharm.Bull.，2004，772，776)。2)APN在粒细胞及淋巴细胞表面大量表达，同时也参与了T淋巴细胞依赖的炎症反应；还能够表达于抗原递呈细胞表面，降解免疫活性物质(如白介素-8)；参与抗原处理和细胞表面的主要组织相容性复合体II型(MHC-II)粘附抗原决定簇依赖的T细胞对抗原的识别，降低了T细胞的识别能力，同时削弱了巨噬细胞和NK细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤能力，使机体免疫力下降。3)APN作为人冠状病毒HCoV-229E和传染性胃肠炎病毒(TGEV)表面的受体，在上呼吸道感染(如：SARS)和急性肠炎中扮演重要角色，且其发挥作用与酶的活性相关(Delmas，B.，et al.Nature，1992，357，417；Yeager，C.L.；et al.Nature，1992，357，420)。4)APN参与HIV病毒颗粒进入宿主细胞的过程。研究表明，在感染HIV的患者体内APN活性远远高于健康志愿者。在HIV-1入侵宿主细胞时，高表达的APN通过降解能够使HIV-1辅助受体CCR5脱敏的趋化因子fMLP，从而降低细胞的天然免疫功能，并使CCR5增敏，促进病毒进入宿主细胞。(Shen W，Li B，et al.Blood，2000，96(8)，2887；Shipp MA，et al.Blood，1993，82(4)，1052)5)APN参与内源性镇痛物质内啡肽和脑啡肽的降解，从而引起P物质的过度释放，导致疼痛。6)APN降解血管紧张素，参与机体血压的调节(Mitsui，T.；et al.Biol.Pharm.Bull.，2004，27，768.)。

90年代以来，开发出许多基质金属蛋白酶(MMPs)抑制剂，大多数为肽或肽的类似物，对酶的降解比较敏感，另外由于大多数具有长链结构，所含的可旋转单键数目比较多，因此对同家族中的成员选择性不好，这也是大多数基质金属蛋白酶(MMPs)抑制剂在临床阶段被枪毙的原因所在。另外针对APN的抑制剂多为天然产物，唯一一个上市的药物乌苯美司具有含β-氨基酸的类二肽结构，目前作为免疫增强剂用于白血病的治疗，但由于是从橄榄网状链霉菌(Streptomyces olivorecticuli)的培养液中分离得到，来源有限。目前文献中所报道的金属蛋白酶抑制剂并没有考虑到对这两者(内肽酶和外肽酶)的选择性问题，因此从作用机制方面没有做深入的探讨。

众所周知，由于多肽分子一般都存在着溶解度小、生物利用度低、代谢稳定性差，极易被体内广泛存在的各种肽酶降解等缺点而限制了其临床应用，类肽(Peptidomimetics，又名肽类似物或肽模拟物)由于其自身的优点有望取代多肽而成为新型的抗肿瘤、抗病毒药物设计与开发的策略：一方面，类肽具有底物的内在活性，可以通过识别酶的活性中心来抑制酶的活性，同时提高对靶部位的选择性和效能；另外，类肽与天然肽类底物存在着结构上的差异不易被肽酶降解，生物稳定性和利用度高，且化合物的作用时间长；另一方面，类肽可以模拟配体的天然构象，与受体的结合部位相匹配，发挥其激动剂或拮抗剂的作用。总之，类肽设计策略为新药设计与开发提供了一个有效的途径，同时也将成为抗肿瘤、抗HIV药物开发的热点领域。

本发明将MMP和APN结合起来进行研究，由于基质金属蛋白酶和氨肽酶N均属于锌离子依赖性水解酶，且均参与细胞外基质主要成分IV型胶原酶的降解和肿瘤新血管的生成，区别仅在于前者为分泌型内肽酶，后者为膜型外肽酶。本发明中在设计化合物时引入了类肽和构象限制策略，一方面可以提高对靶标的识别和选择性，另一方面提高对水解酶的稳定性。本项专利中涉及所设计的类肽化合物对两者的选择性问题，而且通过对类肽化合物结构的优化有望分别开发出特异性选择性抑制剂。本发明中所设计的类肽化合物对MMP的抑制活性处于微摩尔级别且体现出特异的选择性，另外针对于APN活性筛选发现几个药物分子其活性均强于目前唯一上市的乌苯美司。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种α-氨基酰环酰亚胺类肽金属蛋白酶抑制剂及其制备方法和用途。

本发明以光学纯的谷胺酰胺或天冬酰胺为原料，在此基础上通过Boc保护氨基酸的游离氨基、再通过缩合剂环合转化为构象限制的环酰亚胺骨架，提高对靶标的选择性。在相转移催化剂TBAI的条件下以溴乙酸乙酯或溴乙酸苄酯对酰亚胺氮原子烷基化合成关键中间体，脱去中间体的Boc基团游离出的氨基再与Boc保护的氨基酸衍生物以混合酸酐法得到不同系列的类二肽或类三肽。氨基酸由于具有天然性质，因此可以提高化合物对组织的相容性。脱去苄酯保护得到羧基中间体再脱去Boc保护或将羧基转化为其异羟肟酸衍生物再脱去Boc保护基最终得到氨基盐酸盐。目的均是为了增强化合物与酶或受体的亲和力以及代谢稳定性以及改善生物利用度。

本发明设计合成了一类具有全新结构母核的金属蛋白酶抑制剂。体外试验表明其无细胞毒活性但体现出显著的体外抑酶活性，有望成为一类非细胞毒类抗癌候选药物。

本发明的技术方案如下：

具有通式I的类肽化合物及其药学上可接受的盐：

其中，

R₁是天然氨基酸的侧链，优选氢、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、酪氨酸、赖氨酸残基；

R₂是氢；

R₃是OH、OC₂H₅或NHOH；

n是1或2；

*是立体构型为S或R光学纯度或其消旋体。

上述的类肽化合物(I)具体包括如下化合物：

(S)-乙基2-(3-(2-氨基乙酰胺基)-2，6-二氧哌啶-1-基)乙酸酯盐酸盐；

乙基2-((S)-3-((S)-2-氨基丙酰胺基)-2，6-二氧哌啶-1-基)乙酸酯盐酸盐；

乙基2-((S)-3-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-2，6-二氧哌啶-1-基)乙酸酯盐酸盐；

乙基2-((S)-3-((S)-2-氨基-4-甲基戊酰胺基)-2，6-二氧哌啶-1-基)乙酸酯盐酸盐；

乙基2-((S)-3-((2S，3R)-2-氨基-3-甲基戊酰胺基)-2，6-二氧哌啶-1-基)乙酸酯盐酸盐；

乙基2-((S)-3-((S)-2-氨基-3-苯基丙酰胺基)-2，6-二氧哌啶-1-基)乙酸酯盐酸盐；

乙基2-((S)-3-((S)-2-氨基-3-(1H-咪唑-4-基)-丙酰胺基)-2，6-二氧哌啶-1-基)乙酸酯盐酸盐；

乙基2-((S)-3-((S)-2-氨基-4-(甲硫基)丁酰胺基)-2，6-二氧哌啶-1-基)乙酸酯盐酸盐；

乙基2-((S)-3-((S)-2-氨基-3-(1H-吲哚-3-基)-丙酰胺基)-2，6-二氧哌啶-1-基)乙酸酯盐酸盐；

乙基2-((S)-3-((S)-2-氨基-3-(4-羟基苯基)-丙酰胺基)-2，6-二氧哌啶-1-基)乙酸酯盐酸盐；

乙基2-((S)-3-((S)-2，6-二氨基己酰胺基)-2，6-二氧哌啶-1-基)乙酸酯盐酸盐；

乙基2-((S)-2，6-二氧-3-((S)-吡咯烷-2-羰酰胺基)哌啶-1-基)乙酸酯盐酸盐；

(S)-2-(3-(2-氨基乙酰胺基)-2，6-二氧哌啶-1-基)乙酸盐酸盐；

2-((S)-3-((S)-2-氨基丙酰胺基)-2，6-二氧哌啶-1-基)乙酸盐酸盐；

2-((S)-3-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-2，6-二氧哌啶-1-基)乙酸盐酸盐；

2-((S)-3-((S)-2-氨基-4-甲基戊酰胺基)-2，6-二氧哌啶-1-基)乙酸盐酸盐；

2-((S)-3-((2S，3R)-2-氨基-4-甲基戊酰胺基)-2，6-二氧哌啶-1-基)乙酸盐酸盐；

2-((S)-3-((S)-2-氨基-3-苯基丙酰胺基)-2，6-二氧哌啶-1-基)乙酸盐酸盐；

2-((S)-3-((S)-2，6-二氨基己酰胺基)-2，6-二氧哌啶-1-基)乙酸二盐酸盐；

2((S)-2，6-二氧-3-((S)-吡咯烷-2-羰酰胺基)哌啶-1-基)乙酸盐酸盐；

2-((S)-3-((S)-2-氨基-3-(4-羟基-苯基丙酰胺基)-2，6-二氧哌啶-1-基)乙酸盐酸盐；

(S)-2-氨基-N-(1-(2-(羟胺基)-2-氧乙基)-2，6-二氧哌啶-3-基)乙酰胺盐酸盐；

(S)-2-氨基-N-((S)-(1-(2-(羟胺基)-2-氧乙基)-2，6-二氧哌啶-3-基)丙酰胺盐酸盐；

(S)-2-氨基-N-((S)-(1-(2-(羟胺基)-2-氧乙基)-2，6-二氧哌啶-3-基)-3-甲基丁酰胺盐酸盐；

(S)-2-氨基-N-((S)-(1-(2-(羟胺基)-2-氧乙基)-2，6-二氧哌啶-3-基)-4-甲基戊酰胺盐酸盐；

(2S，3R)-2-氨基-N-((S)-(1-(2-(羟胺基)-2-氧乙基)-2，6-二氧哌啶-3-基)-3-甲基戊酰胺盐酸盐；

(S)-2-氨基-N-((S)-(1-(2-(羟胺基)-2-氧乙基)-2，6-二氧哌啶-3-基)-3-苯基丙酰胺盐酸盐；

(S)-2，6-二氨基-N-((S)-(1-(2-(羟胺基)-2-氧乙基)-2，6-二氧哌啶-3-基)-3-己酰胺盐酸盐；

(S)-N-((S)-(1-(2-(羟胺基)-2-氧乙基)-2，6-二氧哌啶-3-基)吡咯烷-2-羰酰胺盐酸盐；

(S)-2-氨基-N-((S)-(1-(2-(羟胺基)-2-氧乙基)-2，6-二氧哌啶-3-基)-3-(4-羟基苯基)丙酰胺盐酸盐；

(S)-2-(3-(2-氨基乙酰胺基)-2，5-二氧氧吡咯-1-基)乙酸盐酸盐；

2-((S)-3-((S)-2-氨基丙酰胺基)-2，5-二氧吡咯-1-基)乙酸盐酸盐；

2-((S)-3-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-2，5-二氧吡咯-1-基)乙酸盐酸盐；

2-((S)-3-((S)-2-氨基-4-甲基戊酰胺基)-2，5-二氧吡咯-1-基)乙酸盐酸盐；

2-((S)-3-((2S，3R)-2-氨基-4-甲基戊酰胺基)-2，5-二氧吡咯-1-基)乙酸盐酸盐；

2-((S)-3-((S)-2-氨基-3-苯基丙酰胺基)-2，5-二氧吡咯-1-基)乙酸盐酸盐；

2-((S)-3-((S)-2，6-二氨基己酰胺基)-2，5-二氧吡咯-1-基)乙酸二盐酸盐；

2-((S)-2，5-二氧-3-((S)-吡咯烷-2-羰酰胺基)吡咯-1-基)乙酸盐酸盐；

2-((S)-3-((S)-2-氨基-3-(4-叔丁氧羰氧基)苯基丙酰胺基)-2，5-二氧吡咯-1-基)乙酸盐酸盐；

(S)-2-氨基-N-(1-(2-(羟胺基)-2-氧乙基)-2，5-二氧吡咯-3-基)乙酰胺盐酸盐；

(S)-2-氨基-N-((S)-(1-(2-(羟胺基)-2-氧乙基)-2，5-二氧吡咯-3-基)丙酰胺盐酸盐；

(S)-2-氨基-N-((S)-(1-(2-(羟胺基)-2-氧乙基)-2，5-二氧吡咯-3-基)-3-甲基丁酰胺盐酸盐；

(S)-2-氨基-N-((S)-(1-(2-(羟胺基)-2-氧乙基)-2，5-二氧吡咯-3-基)-4-甲基戊酰胺盐酸盐；

(2S，3R)-2-氨基-N-((S)-(1-(2-(羟胺基)-2-氧乙基)-2，5-二氧吡咯-3-基)-3-甲基戊酰胺盐酸盐；

(S)-2-氨基-N-((S)-(1-(2-(羟胺基)-2-氧乙基)-2，5-二氧吡咯-3-基)-3-苯基丙酰胺盐酸盐；

(S)-2，6-二氨基-N-((S)-(1-(2-(羟胺基)-2-氧乙基)-2，5-二氧吡咯-3-基)-3-己酰胺盐酸盐；

(S)-N-((S)-(1-(2-(羟胺基)-2-氧乙基)-2，5-二氧吡咯-3-基)吡咯烷-2-羰酰胺盐酸盐；

(S)-2-氨基-N-((S)-(1-(2-(羟胺基)-2-氧乙基)-2，5-二氧吡咯-3-基)-3-(4-羟基苯基)丙酰胺盐酸盐。

上述通式(I)的类肽化合物中间体为：(S)-叔丁基2，6-二氧哌啶-3-基羰酰胺；(S)-乙基2-(3-(叔丁氧羰酰胺基)-2，6-二氧哌啶-1-基)乙酸酯；(S)-乙基2-(3-氨基)-2，6-二氧哌啶-1-基)乙酸酯；(S)-苄基-2-(3-(叔丁氧羰酰胺基)-2，6-二氧哌啶-1-基)乙酸酯；(S)-叔丁基2，5-2，5-二氧吡咯-3-基羰酰胺；(S)-苄基-2-(3-(叔丁氧羰酰胺基)-2，5-二氧吡咯-1-基)乙酸酯。

上述类肽化合物的制备方法，以光学纯的谷胺酰胺或天冬酰胺为原料，通过Boc保护、环合、在相转移催化剂的条件下烷基化合成关键中间体，再通过与Boc保护的氨基酸衍生物以混合酸酐法得到不同系列的类二肽或类三肽，脱去苄酯保护得到羧基中间体再脱Boc保护或将羧基转化为其异羟肟酸衍生物再脱去Boc保护基得到氨基盐酸盐。

这些类肽化合物在预防或治疗与金属蛋白酶，包括基质金属蛋白酶(MMP)和氨肽酶N，活性异常表达相关的哺乳动物疾病的药物的应用。

所述的与金属蛋白酶活性异常表达的相关哺乳动物疾病包括：炎症，癌症，多发性硬化症，各种组织渍疡或组织溃疡性病症，牙周病，大疱性表皮松懈症，白血病等。因此，本发明还涉及含有(I)结构化合物的药物组合物。

一种药物组合物，包含(1)上述任一项的类肽化合物，和(2)一种或多种药学上可接受载体或赋形剂。

此外，本发明还包括一种适于口服给予哺乳动物的药物组合物，包含(1)上述任一类肽化合物，和(2)药学上可接受载体，任选包含(3)一种或多种药学上可接受的赋形剂。

此外，本发明还包括一种适于胃肠外给予哺乳动物的药物组合物，包含(1)上述任一类肽化合物，和(2)药学上可接受载体，任选包含(3)一种或多种药学上可接受的赋形剂。

本发明含有通式(I)的化合物的设计首次采用了类肽和构象设计策略。类肽和构象限制策略已经被广泛应用于抗病毒、抗肿瘤药物的设计和开发领域，其结构由天然或非天然氨基酸组成类似于肽的结构，但总体构象由不同于天然的多肽物质，一方面，类肽具有底物的内在活性，可以通过识别酶的活性中心来抑制酶的活性，同时提高对靶部位的选择性和效能；另外，类肽与天然肽类物质存在着结构上的差异不易被肽酶降解，生物稳定性和利用度高，且化合物的作用时间长。

发明详述

所用的定义和术语

本文中所用的术语和定义含义如下：

“药学上可接受的盐”是指式(I)化合物具有疗效且无毒的盐形式。其可由任一酸性基团(如羧基)形成阴离子盐，或由任一碱性基团(如氨基)形成阳离子盐。本领域已知许多这样的盐。在任何酸性基团(如羧基)上形成的阳离子盐，或是在任何碱性基团(如氨基)上形成的阴离子盐。这些盐由许多式本领域已知的，如阳离子盐包括碱金属(如钠和钾)和碱土金属(如镁和钙)的盐以及有机盐(如铵盐)。还可通过使用相应的酸处理碱性形式的(I)方便地获得阴离子盐，这样的酸包括无机酸如硫酸、硝酸、磷酸等；或有机酸如乙酸、丙酸、羟基乙酸、2-羟基丙酸、2-氧代丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、2-羟基-1，2，3-丙三酸、甲磺酸、乙磺酸、苯甲磺酸、4-甲基苯磺酸、环己基亚磺酸、2-羟基苯甲酸、4-氨基-2-羟基苯甲酸等。这些盐式熟练技术人员熟知的，熟练的技术人员可制备本领域知识所提供的任何盐。此外，熟练技术人员可根据溶解度、稳定性、容易制剂等取某种盐而舍另一种盐。这些盐的测定和最优化在熟练技术人员的经验范围内。

式(I)类肽化合物还可以其它被保护的形式或衍生物的形式存在，这些形式对本领域技术人员而言是显而易见的，均应该包含于本发明的范围内。

合成

目标化合物经如下路线合成。

简言之，上述通式(I)的类肽化合物的制备方法，本发明以光学纯的谷胺酰胺或天冬酰胺为原料，在此基础上通过Boc保护氨基酸的游离氨基、再通过缩合剂环合转化为构象限制的环酰亚胺骨架，提高对靶标的选择性。在相转移催化剂TBAI的条件下以溴乙酸乙酯或溴乙酸苄酯对酰亚胺氮原子烷基化合成关键中间体，脱去中间体的Boc基团游离出的氨基再与Boc保护的氨基酸衍生物以混合酸酐法得到不同系列的类二肽或类三肽，氨基酸由于具有天然性质，因此可以提高化合物对组织的相容性。脱去苄酯保护得到羧基中间体再脱去Boc保护或将羧基转化为其异羟肟酸衍生物再脱去Boc保护基最终得到氨基盐酸盐。目的均是为了增强化合物与酶或受体的亲和力以及代谢稳定性以及改善生物利用度。具体合成路线根据所要制备的某种具体的化合物结合本领域的现有技术进行设计。

下面以具有苯丙氨酸侧链的环酰亚胺类肽衍生物为例，说明部分该类化合物的合成路线及制备方法。

合成路线一

试剂：a N-羟基琥珀酰业胺，二环己基碳二亚胺，四氢呋喃，66℃；b溴乙酸乙酯，四丁基碘化氨，丙酮，碳酸钾，56℃；c三氟乙酸，二氯甲烷；d Boc保护氨基酸，三乙胺，四氢呋喃，二环己基碳二亚胺，1-羟基-苯并-三氮唑；e乙酸乙酯-氯化氢溶液。

合成路线二

试剂：a溴乙酸苄酯，四丁基碘化氨，丙酮，碳酸钾，56℃；b三氟乙酸，二氯甲烷；c N-甲基吗啡啉，四氢呋喃，氯甲酸异丁酯，Boc保护氨基酸；d环己烯，乙醇，5％钯/碳，45℃；e乙酸乙酯-氯化氢溶液；f氯甲酸异丁酯，三乙胺，四氢呋喃，盐酸羟胺。

合成路线三

试剂：a N-羟基琥珀酰亚胺，二环己基碳二亚胺，四氢呋喃，66℃；b溴乙酸苄酯，四丁基碘化氨，丙酮，碳酸钾，56℃；c三氟乙酸，二氯甲烷；d N-甲基吗啡啉，四氢呋喃，氯甲酸异丁酯，Boc保护氨基酸；e环己烯，乙醇，5％钯/碳，45℃；f乙酸乙酯-氯化氢溶液；g氯甲酸异丁酯，三乙胺，四氢呋喃，盐酸羟胺。

本领域技术人员可以对上述步骤进行变动以提高收率，他们可据本领域的基本知识确定合成的路线，如选择反应物，溶剂和温度，可以通过使用各种常规保护基以避免副反应的发生从而提高收率。这些常规的保护方法可参见例如T.Greene，Protecting Groups in OrganicSynthesis.

显然，上述路线为立体选择性合成，可通过上述路线还可制备得到其光学活性的类肽化合物。本领域技术人员可方便地获得环酰亚胺衍生物的各种其他异构体，并可通过常规的分离手段纯化，如手性盐或手性层析柱等。

MMPs抑制活性的测试描述于Vijaykumar，M.B.等，Matrix Biol.2000，19，26中。琥珀酰明胶已证明能被明胶酶(包括MMP-2，-9)水解，肽键水解产生的游离氨基浓度的高低与酶活性大小呈正相关。琥珀酸酐保护明胶中的游离氨基，水解后暴露的伯氨与2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)反应显色，通过检测450nm处的吸收度确定氨基含量，从而确定明胶酶的活性。

APN抑制活性的测试描述于Lejczak，B等.Biochemistry，1989，28，3549中。底物L-亮氨酰-p-硝基苯胺被APN降解，产生在405nm有吸收的p-硝基苯胺，并且p-硝基苯胺的浓度与酶活性的大小呈正相关。通过检测405nm处的吸收度确定p-硝基苯胺的含量，从而确定氨肽酶的活性，间接反映出抑制剂对酶活性抑制程度的大小。

通式(I)的类肽化合物的体外抑酶试验证明该类肽化合物为一种环酰亚胺类肽金属蛋白酶抑制剂。

本发明的环酰亚胺衍生物在空间上与金属蛋白酶的活性位点相匹配，因此在体外显示了较高的抑制活性。

制剂，药物组合物，剂量和服用

本发明的环酰亚胺衍生物可以游离形式或以盐形式存在。本领域熟练人员已知许多化合物类型的药学上可接受的盐及其制备方法。药学上可接受的盐包括常规的无毒性的盐，包括这样的化合物碱与无机或有机酸形成的季铵盐。

本发明的化合物可形成水合物或溶剂合物。本领域熟练人员已知将化合物与水一起冻干时所形成的水合物或在溶液中与合适的有机溶剂浓缩时形成溶剂合物的方法。

本发明包含含有治疗量本发明化合物的药物，和一种或多种药学上可接受载体和/或赋形剂的药物组合物。载体包括如盐水，缓冲盐水，葡萄糖，水，甘油，乙醇和它们的结合物，下文更详细地论述。如果需要，该组合物还可以包含较小量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。该组合物可以是液体，悬浮液，乳剂，片剂，丸剂，胶囊，持续释放制剂或粉末。该组合物可以用传统的黏合剂和载体如三酸甘油酯配制成栓剂。口服制剂可以包括标准载体如药物品级的甘露糖醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，纤维素和碳酸镁等等。视需要制剂而定，配制可以设计混合，制粒和压缩或溶解成分。在另一个途径中，该组合物可以配制成纳米颗粒。

使用的药物载体可以为，例如，固体或者液体。

典型的固体载体包括乳糖，石膏粉，蔗糖，滑石，凝胶，琼脂，果胶，阿拉伯胶，硬脂酸镁，硬脂酸等等。固体载体可以包括一种或多种可能同时作为增香剂，润滑剂，增溶剂，悬浮剂，填料，助流剂，压缩助剂，粘合剂或片剂-崩解剂的物质；它还可以是包封材料。在粉末中，载体为精细粉碎的固体，它与精细粉碎的活性成分的混合。在片剂中，火星成分与具有必要的压缩性质的载体以合适的比例混合，以需要的形状和大小压缩。粉末和片剂优选包含至多99％活性成分。合适的固体载体包括，例如，磷酸钙，硬脂酸镁，滑石，糖，乳糖，糊精，淀粉，凝胶，纤维素，甲基纤维素，羧甲基纤维素钠盐，聚乙烯吡咯烷酮烷酮，低熔点蜡和离子交换树脂。

典型的液体载体包括糖浆，花生油，橄榄油，水，等等。液体载体用于制备溶液，悬浮液，乳剂，糖浆，酊剂和密封的组合物。活性成分可以溶解或悬浮于药学上可接受的液体载体如水，有机溶剂，二者的混合物或药学上可接受的油类或脂肪。液体载体可以包含其他合适的药物添加剂如增溶剂，乳化剂，缓冲剂，防腐剂，增甜剂，增香剂，悬浮剂，增稠剂，颜料，粘度调节剂，稳定形或渗透压-调节剂。用于口服和肠胃外给药的液体载体的合适的例子包括水(部分地包含如同上述的添加剂，例如纤维素衍生物，优选羧甲基纤维素钠盐溶液)，醇(包括一元醇和多元醇，例如乙二醇)和它们的衍生物，和油类(例如分馏椰子油和花生油)。用于肠胃外给药的载体还可以为油脂如油酸乙酯和异丙基肉豆蔻酸盐。无菌的液体载体用于肠胃外给药的无菌的液态组合物。用于加压组合物的液体载体可以为卤代烃或其他药学上可接受的推进剂。无菌溶液或悬浮溶液液体药物组合物可以用来，例如，静脉内，肌内，腹膜内或皮下注射。注射时可单次推入或逐渐注入，入30分钟的经脉内灌注。该化合物还可以以液体或者固体组合物的形式口服给药。

载体或赋形剂可以包括本领域已知的时间延迟材料，如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯，还可包括蜡，乙基纤维素，羟内基甲基纤维素，异丁烯酸甲酯等等。当制剂用于口服时，公认PHOSALPG-50(phospholipid与1，2-丙二醇浓缩，A.Nattermann&Cie.GmbH)中的0.01％吐温80用于其他化合物的可接受的口服制剂的配制，可以适应于本发明各种化合物的配制。

给予本发明化合物时可以使用各式各样的药物形式。如果使用固体载体，制剂可以为片剂，被放入硬胶囊中的粉末或小药丸形式或锭剂或糖锭形式。固体载体的量在很大程度上变化，但是优选从约25mg到约1.0g。如果使用液体载体，制剂可以为糖浆，乳剂，软胶囊，在安瓿或小瓶或非水的液体悬浮液中的无菌注射溶液或悬浮液。

为了获得稳定的水溶性的剂型，可以将化合物或其药学上可接受的盐溶于有机或无机酸的水溶液，0.3M琥珀酸或柠檬酸溶液。选择性地，酸性的衍生物可以溶于合适的碱性溶液。如果得不到可溶形式，可将化合物溶于合适的共溶剂或它们的结合。这样的合适的共溶剂的例子包括，但是不局限于，浓度范围从0-60％总体积的乙醇，丙二醇，聚乙二醇300，聚山梨酸酯80，甘油，聚氧乙烯脂肪酸酯，脂肪醇或甘油羟脂肪酸酯等等。

各种释放系统是已知的并且可以用于化合物或其他各种制剂的给药，这些制剂包括片剂，胶囊，可注射的溶液，脂质体中的胶囊，微粒，微胶囊，等等。引入的方法包括但是不局限于皮肤的，皮内，肌内，腹膜内的，静脉内的，皮下的，鼻腔内的，肺的，硬膜外的，眼睛的和(通常优选的)口服途径。化合物可以通过任何方便的或者其它适当的途径给药，例如通过注入或快速浓注，通过上皮的或粘膜线路(例如，口腔粘膜，直肠和肠粘膜，等等)吸收或通过负载药物的支架以及可以于其他生物活性剂一起给药。可以全身或局部给药。用于鼻，支气管或肺疾病的治疗或预防时，优选的给药途径为口服，鼻给药或支气管烟雾剂或喷雾器。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但不限于此。

实施例1.乙基2-((S)-3-((S)-2-氨基-3-苯基丙酰胺基)-2，6-二氧哌啶-1-基)乙酸酯盐酸盐(6f)的制备

(S)-叔丁基2，6-二氧哌啶-3-基羰酰胺(2)

Boc-L-谷氨酰胺(41.6g，0.17mol)和N-羟基琥珀酰亚胺(NIISu，19.5g，0.17mol)溶解于200ml THF中，冰盐浴条件下缓慢滴加100ml含有DCC(35.1g，0.17mol)的THF溶液。约1小时滴完，撤冰浴室温搅拌3小时后回流10小时。反应液冷却至室温，旋转蒸发回收溶剂。残留物加入50ml乙酸乙酯再浓缩一次。最终残留物加入200ml乙酸乙酯后，冰箱冷冻放置过夜。以4.0克硅藻土过滤，滤液水(50ml*1)和饱和盐水(50ml*1)洗涤，NaSO₄干燥.过滤，浓缩至干。再以乙酸乙酯-乙醚精致得片状结晶35.7g，收率75％：mp 211.5-213.8℃(文献值212-214℃)；IR(KBr，cm^-1)：3356，3247，1728，1695，1531；ESI-MS m/z[M+1]⁺：229.6；1H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)：10.76(s，1H)，4.27-4.18(m，1H)，2.77-2.65(m，2H)，1.95-1.87(m，2H)，1.39(s，9H)。

(S)-乙基2-(3-(叔丁氧羰酰胺基)-2，6-二氧哌啶-1-基)乙酸酯(3)

将化合物2(14.6g，0.064mol)，K₂CO₃(10.6g，1.2e.q)，四丁基碘化铵(TBAI，2.5g，0.1e.q.)混旋于500ml无水丙酮。室温条件下缓慢加入溴乙酸乙酯(11.0ml，1.5e.q.)。反应液回流过夜(约24hs)，冷却至室温。过滤，浓缩得黄色油状物。加入100ml乙酸乙酯，有机相分别以0.5％Na₂CO₃(10ml*3)，饱和柠檬酸(10ml*2)、饱和盐水洗至中性，有机相以无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩再以乙酸乙酯-乙醚重结晶得13白色粉末16.0g，收率80％；mp134.5-136.3℃；ESI-MS m/z[M+1]⁺315；1H-NMR(300MHz，CDCl₃)：δ5.36(brs，1H)，4.59-4.41(m，1H)，4.57-4.43(dd，2H，J＝30.6，24.6)，4.22-4.15(q，2H，J＝7.2)，2.96-2.88(m，1H)，2.82-2.70(m，1H)，2.54-2.50(m，1H)，1.97-1.84(m，1H)，1.46(s，9H)，1.30-1.25(t，3H，J＝7.2)。

(S)-乙基2-(3-氨基)-2，6-二氧哌啶-1-基)乙酸酯(4)

将化合物3(2.0g，5.5mmol)溶解于22ml二氯甲烷，待完全溶解后，缓慢滴加5.5mlTFA，约20min加完，室温搅拌3小时，将反应液浓缩，再加入20ml二氯甲烷蒸干，重复两次。加入20ml无水DCM冰箱冷藏备用；ESI-MS m/z[M+1]⁺215.2。

乙基2-((S)-3-((S)-2-(叔丁氧羰酰胺基)-3-苯基丙酰胺基)-2，6-二氧哌啶-1-基)乙酸酯(5f)

将7mmol Boc-L-苯丙氨酸溶解于20mlDCM，加入HOBt(8.4mmol，1.14g)，冰浴条件下搅拌，缓慢加入含有DCC(8.4ml，1.73g)的DCM溶液，约30min加完，撤去冰浴室温反应2-3小时，过滤，滤液备用。

将含有10mmol化合物4的DCM备用液，冰浴条件下以三乙胺(约2个当量)控制pH值在7，缓慢滴加20ml含7mmol上述Boc保护的L-氨基酸活性酯的DCM溶液，控制反应液的pH在7，通N₂保护，室温搅拌过夜，反应液过滤，先后以0.5％Na₂CO₃(5ml*2)，5％柠檬酸(5ml*2)，饱和盐水(5ml*2)洗涤，无水硫酸钠干燥，柱层析分离纯化，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，得中间体5f白色粉末2.95g，收率91.3％；mp 164.1-164.2℃；ESI-MS m/z[M+1]⁺462.6；1H-NMR(300MHz，CDCl₃)：δ7.33-7.18(m，5H)，6.85-6.83(brd，1H，)，4.94(brs，1H)，4.56-4.40(m，4H)，4.21-4.14(q，2H，J＝7.2)，3.12-3.10(d，2H，J＝6.3)，2.93-2.79(m，2H)，2.56-2.51(m，1H)，1.94-1.67(m，2H)，1.45(s，9H)，1.32-1.24(t，3H，J＝7.2)。

乙基2-((S)-3-((S)-2-氨基-3-苯基丙酰胺基)-2，6-二氧哌啶-1-基)乙酸酯盐酸盐(6f)

将化合物5f(0.5g)溶解于10ml 3N HCl-AcOEt，待完全溶解后，室温搅拌4小时，产物6f以盐酸盐的形式析出，过滤、无水乙酸乙酯洗涤，干燥得白色固体粉末0.48g，收率86.4％；mp 156.3-158.0℃；ESI-MS m/z[M+1]⁺：362.4；1H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ9.19-9.16(d，1H，)，8.23(brs，3H)，7.35-7.27(m，5H)，4.87-4.79(m，1H)，4.45-4.34(dd，2H)，4.14-4.07(m，3H)，3.23-3.20(m，1H)，33.05-2.93(m，2H)，2.82-2.74(m，1H)，2.04-2.01(m，2H)，1.22-1.17(t，3H，J＝7.2)。

实施例2.2-((S)-3-((S)-2-氨基-4-甲基戊酰胺基)-2，6-二氧哌啶-1-基)乙酸盐酸盐(11d)的制备

(S)-苄基-2-(3-(叔丁氧羰酰胺基)-2，6-二氧哌啶-1-基)乙酸酯(7)

将化合物2(18.3g，0.086mol)，K₂CO₃(14.2g，1.2e.q)，四丁基碘化铵(TBAI，3.1g，0.1e.q.)混旋于300ml无水丙酮。室温条件下缓慢加入溴乙酸苄酯(30.0g，1.5e.q.)。反应液回流7小时，冷却至室温。过滤，浓缩得黄色油状物。加入200ml乙酸乙酯，有机相分别以0.5％Na₂CO₃(20ml*2)，5％柠檬酸(20ml*2)、饱和盐水洗至中性，有机相以无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩再以乙酸乙酯-乙醚重结晶得7白色结晶20.8g，收率67％。mp 78.0-81.0℃；ESI-MS m/z[M+1]⁺：377.6；1H-NMR(300MHz，CDCl₃)：δ7.42-7.31(m，5H)，5.18-5.10(s，2H)，4.43-4.36(m，3H)，2.99-2.87(m，1H)，2.75-2.69(m，1H)，2.01-1.93(m，2H)，1.40(s，9H)。苄基2-((S)-3-((S)-2-(叔丁氧羰酰胺基)-4-甲基戊酰胺基)-2，6-二氧哌啶-1-基)乙酸酯(9d)

将化合物7(2.0g，5.5mmol)溶解于22ml二氯甲烷，待完全溶解后，缓慢滴加5.5mlTFA，约20min加完，室温搅拌3小时，将反应液浓缩，再加入20ml二氯甲烷蒸干，重复两次。加入20ml无水THF冰箱冷藏备用。

将上述化合物8的THF溶液冷却至-20℃，缓慢滴加N-甲基吗啡啉(约1.3ml)，使溶液的pH值在6左右，得溶液I。将5.5mmol氨基酸衍生物溶解于20ml无水THF，控制溶液温度不高于-20℃，缓慢加入5.5mmol(0.62ml)N-甲基吗啡啉，5min后缓慢加入5.5mmol(0.72ml)氯甲酸异丁酯(ISC)，出现白色浑浊说明制备混合酸酐的反应已经发生。反应液在-20℃搅拌15min，将上述pH6的THF溶液缓慢滴加至混合酸酐的反应液，约20min滴完。继续在-20℃保温反应15min，更换冷却液(冰浴)至0℃，搅拌反应，TLC检测反应进程。

反应完毕后，以2.0g硅藻土过滤，浓缩，加入80ml乙酸乙酯，先后以0.5％Na₂CO₃(20ml*2)，5％柠檬酸(20ml*1)，饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，浓缩，干燥得关键中间体9d白色粉末2.49g，收率92.6％；mp 61.0-62.6℃；ESr-MS m/z[M+1]⁺490.6，无需纯化可直接用于下步反应。

2-((S)-3-((S)-2-(叔丁氧羰酰胺基)-4-甲基戊酰胺基)-2，6-二氧哌啶-1-基)乙酸(10d)

将4.0mmol苄酯衍生物9d溶解于40ml无水乙醇，加入20ml环己烯作为供氢体，加入等量5％的Pd/C催化剂，45℃保温反应1小时，TLC监测反应进程。反应完毕后将反应液用2.0g硅藻土过滤，上层Pd/C催化剂回收，滤液浓缩至干，所得残留物以60ml乙酸乙酯，先后以5％柠檬酸(10ml*2)，饱和盐水(10ml*1)洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，浓缩，无水乙醇重结晶的白色固体粉末10d 1.46g，收率91.4％；mp 91.2-92.0℃；ESI-MS m/z[M+1]⁺400.4。

2-((S)-3-((S)-2-氨基-4-甲基戊酰胺基)-2，6-二氧哌啶-1-基)乙酸盐酸盐(11d)

将0.5g化合物9d溶解于5ml 3N HCl-AcOEt，待完全溶解后，室温搅拌4小时，产物11d以盐酸盐的形式析出，过滤、洗涤得白色固体粉末0.32g，收率95.2％；mp 156.5-158.1℃；ESI-MS m/z[M+1]⁺300.3；1H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ9.05(d，1H)，8.40(brs，3H)，4.89-4.80(m，1H)，4.35-4.23(dd，2H，J＝20.4，17.1)，3.81-3.76(t，1H)，3.05-2.73(m，2H)，2.05-1.99(m，2H)，1.84-1.73(m，1H)，1.03-0.90(d，6H，J＝6.9)。

实施例3.叔丁基(S)-1-((S)-1-(2-(羟胺基)-2-氧代乙基)-2，6-二氧哌啶-3-氨基)-4-甲基-1-氧代戊烷-2-羧酸酯(13d)的制备

将0.2g(3.0mmol)盐酸羟胺溶解于1.5ml无水甲醇，缓慢加入0.5ml(2e.q)的三乙胺，使氨基游离出来，精密量取上清液，备用。

将2.0mmol羧酸衍生物10d溶解于20ml无水THF，控制溶液温度不高于-20℃，缓慢加入4.0mmol(0.57ml)三乙胺，5min后缓慢加入2.02mmol(0.28ml)氯甲酸异丁酯(ISC)，出现白色浑浊说明制备混合酸酐的反应已经发生。反应液在-20℃搅拌15min，将含羟胺的甲醇溶液缓慢滴加至混合酸酐的反应液，约20min滴完。继续在-20℃保温反应15min，更换冷却液(冰浴)至0℃，搅拌反应，TLC检测反应进程。反应完毕后硅藻土过滤，浓缩，加入30ml乙酸乙酯，先后用0.05％NaHCO₃(5ml*2)，5％柠檬酸(5ml*1)，饱和盐水洗涤至中性，无水硫酸钠干燥。将乙酸乙酯溶液过滤浓缩，得到12d类白色固体粉末0.78g，收率94.1％；ESI-MS m/z[M+1]⁺415.4。

上述化合物12d溶解于5ml 3N HCl-AcOEt，待完全溶解后，室温搅拌2-3小时，产物13d以盐酸盐的形式析出，过滤、洗涤得白色固体粉末0.42g，收率79.8％；mp 176.3-176.9℃；ESI-MS m/z[M+1]⁺315.3；1H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ8.89(brs，1H)，8.25(brs，3H)，4.90-4.85(brs，1H)，4.66-4.59(m，1H)，4.57-4.25(dd，2H)，3.98-3.75(m，1H)，3.06-2.96(m，1H)，2.81-2.66(m，1H)，2.01-1.98(s，2H)，1.82-1.74(m，1H)，1.68-1.55(m，2H)，0.95-0.80(d，6H)。

实施例4.2-((S)-3((S)-2-氨基-3-苯基丙酰胺基)-2，6-二氧哌啶-1-基)乙酸盐酸盐(11f)的制备

同实施例2中9d-11d的制备方法，分别制得9f-11f。

苄基2-((S)-3-((S)-2-(叔丁氧羰酰胺基)-3-苯基丙酰胺基)-2，6-二氧哌啶-1-基)乙酸酯(9f)：

白色粉末2.54g，收率88.2％，mp 139.4-140.4℃；ESI-MS m/z[M+1]⁺524.6；1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.39-7.18(s，10H)，6.80(s，1H)，5.19-5.15(s，2H)，4.93(m，1H)，4.62-4.46(m，3H)，3.11-3.09(d，2H，J＝6.0)，2.93-2.72(m，2H)，2.50(m，1H)，1.87-1.72(m，1H)，1.41(s，9H))。

2-((S)-3-((S)-2-(叔丁氧羰酰胺基)-3-苯基丙酰胺基)-2，6-二氧哌啶-1-基)乙酸(10f)：

白色粉末1.28g，收率73.8％；mp 89.2-91.5℃；ESI-MS m/z[M+1]⁺434.5；1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.30-7.17(m，5H)，5.27-5.25(s，1H)，4.67-4.41(m，4H)，3.07-2.74(m，4H)，2.39-2.32(m，1H)，1.90-1.88(m，1H)，1.36(s，9H)。

2-((S)-3-((S)-2-氨基-3-苯基丙酰胺基)-2，6-二氧哌啶-1-基)乙酸盐酸盐(11f)：

白色粉末0.32g，收率93.8％；mp 135.6-138.2℃；ESI-MS m/z[M+1]⁺334.3；1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ9.15(s，1H)，8.24(brs，3H)，7.35-7.28(s，5H)，4.87-4.78(m，1H)，4.37-4.25(dd，2H，J＝19.2，16.8)，4.07-3.99(m，1H)，3.24-3.19(m，1H)，3.04-2.92(m，2H)，2.79-2.72(m，1H)，2.01-1.99(m，2H)。

实施例5.(S)-2-氨基-N-((S)-(1-(2-(羟胺基)-2-氧乙基)-2，6-二氧哌啶-3-基)-3-苯基丙酰胺盐酸盐(13f)的制备

同实施例2中12d，13d的制备方法，分别制得12f，13f。

叔丁基(S)-1-((S)-1-(2-(羟胺基)-2-氧代乙基)-2，6-二氧哌啶-3-氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-羧酸酯(12f)：

白色粉末0.80g，收率89.2％；mp 101.1-102.6℃；ESI-MS m/z[M+1]⁺449.3；1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ10.25(brs，1H)，7.80(s，1H)，7.26-7.19(s，5H)，5.44(s，1H)，4.65-4.35(m，4H)，3.12-2.75(m，4H)，2.05(m，2H)，1.32(s，9H)。

(S)-2-氨基-N-((S)-(1-(2-(羟胺基)-2-氧乙基)-2，6-二氧哌啶-3-基)-3-苯基丙酰胺盐酸盐(13f)：

白色粉末0.49g，收率84.9％；mp 171.1-172.6℃；ESI-MS m/z[M+1]⁺349.4；1H-NMR(300MHz，DMSO-d⁶)：δ10.62(s，1H)，8.86(s，1H)，8.24(s，1H)，7.38-7.26(s，5H)，4.88-4.80(m，1H)，4.23-4.10(dd，2H，J＝20.7，15.6)，3.24-3.18(m，1H)，3.05-2.87(m，2H)，2.73-2.71(m，1H)，2.01-1.98(s，2H)。

实施例6.2-((S)-3-((S)-2-氨基-3-苯基丙酰胺基)-2，5-二氧吡咯-1-基)乙酸盐酸盐(20f)的制备

(S)-叔丁基2，5-2，5-二氧吡咯-3-基羰酰胺(15)

化合物14(23.2g，0.1mol)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHSu，13.8g，0.12mol)溶解至400ml THF中，冰盐浴条件下缓慢滴加100ml含有DCC(35.1g，0.17mol)的THF溶液。约1小时滴完，撤冰浴室温搅拌3小时后回流10小时。反应液冷却至室温，旋转蒸发回收溶剂。残留物加入50ml乙酸乙酯再浓缩一次。最终残留物加入200ml乙酸乙酯后，冰箱冷冻放置过夜。以4.0克硅藻土过滤，滤液水(50ml*1)和饱和盐水(50ml*1)洗涤，NaSO₄干燥.过滤，浓缩至干。再以乙酸乙酯-乙醚精致得15片状结晶18.3g，收率85％：mp 168.2-168.7℃；ESI-MS m/z[M+1]⁺215.3；1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ11.19(s，1H)，7.46-7.43(d，1H，J＝8.7)，4.33-4.25(m，1H)，2.89-2.80(dd，2H，J＝17.7，9.3)，1.95-1.87(m，2H)，1.39(s，9H)。

(S)-苄基-2-(3-(叔丁氧羰酰胺基)-2，5-二氧吡咯-1-基)乙酸酯(16)

将化合物15(18.3g，0.086mol)，K₂CO₃(14.2g，1.2e.q)，四丁基碘化铵(TBAI，3.1g，0.1e.q.)混旋于300ml无水丙酮。室温条件下缓慢加入溴乙酸苄酯(30.0g，1.5e.q.)。反应液回流7小时，冷却至室温。过滤，浓缩得黄色油状物。加入200ml乙酸乙酯，有机相分别以0.5％Na₂CO₃(20ml*2)，5％柠檬酸(20ml*2)、饱和盐水洗至中性，有机相以无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩再以乙酸乙酯-乙醚重结晶得16白色结晶20.8g，收率67％：mp 107.0-112.0℃；ESI-MS m/z[M+1]⁺363.5；1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.58(brs，1H)，7.38(s，5H)，5.17(s，2H)，4.47(m，1H)，4.285(m，2H)，3.06-3.03(m，1H)，2.64-2.58(m，1H)，1.38(s，9H)。

苄基2-((S)-3-((S)-2-(叔丁氧羰酰胺基)-3-苯基丙酰胺基)-2，5-二氧吡咯-1-基)乙酸酯(18f)：

将化合物16(2.0g，5.5mmol)溶解于22ml二氯甲烷，待完全溶解后，缓慢滴加5.5mlTFA，约20min加完，室温搅拌3小时，将反应液浓缩，再加入20ml二氯甲烷蒸干，重复两次。加入20ml无水THF冰箱冷藏备用。

将上述17的THF溶液冷却至-20℃，缓慢滴加N-甲基吗啡啉(约1.3ml)，使溶液的pH值在6左右，得溶液I。将5.5mmol氨基酸衍生物溶解于20ml无水THF，控制溶液温度不高于-20℃，缓慢加入5.5mmol(0.62ml)N-甲基吗啡啉，5min后缓慢加入5.5mmol(0.72ml)氯甲酸异丁酯(ISC)，出现白色浑浊说明制备混合酸酐的反应已经发生。反应液在-20℃搅拌15min，将上述pH6的THF溶液缓慢滴加至混合酸酐的反应液，约20min滴完。继续在-20℃保温反应15min，更换冷却液(冰浴)至0℃，搅拌反应，TLC检测反应进程。

反应完毕后，以2.0g硅藻土过滤，浓缩，加入80ml乙酸乙酯，先后以0.5％Na₂CO₃(10ml*2)，5％柠檬酸(10ml*1)，饱和盐水洗至中心，无水硫酸钠干燥。过滤，浓缩得关键中间体18f无色油状物3.24g，收率90.8％；ESI-MS m/z[M+1]+510.6，1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.39-7.17(m，10H)，6.97-6.94(d，1H)，5.16(s，2H)，5.06-5.04(m，1H)，4.39-4.33(m，4H)，3.10-3.01(m，3H)，2.75-2.67(m，1H)，1.39(s，9H)。

2-((S)-3-((S)-2-(叔丁氧羰酰胺基)-3-苯基丙酰胺基)-2，5-二氧吡咯-1-基)乙酸(19f)

将4.0mmol苄酯衍生物18f溶解于40ml无水乙醇，加入20ml环己烯作为供氢体，加入等量5％的Pd/C催化剂，45℃保温1小时，TLC监测反应进程。反应完毕后将反应液用4.0g硅藻土过滤，上层Pd/C催化剂回收，滤液浓缩至干，所得残留物以60ml乙酸乙酯，先后以5％柠檬酸(10ml*2)，饱和盐水(10ml*1)洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤浓缩，无水乙醇重结晶的得色固体粉末1.86g，收率86.9％；mp 93.1-94.8℃；ESI-MS m/z[M+1]⁺420.4；¹H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.61(s，1H)，7.21-7.06(s，5H)，5.52(m，1H)，4.59-4.50(m，1H)，4.33-4.18(dd，2H，J＝29.1，17.4)，3.17-2.62(m，4H)，1.91-1.51(m，2H)，1.34(d，9H)。

2-((S)-3-((S)-2-氨基-3-苯基丙酰胺基)-2，5-二氧吡咯-1-基)乙酸盐酸盐(20f)

将0.3-0.5g羧基化合物19溶解于5ml 3N HCl-AcOEt，待完全溶解后，室温搅拌2-3小时，产物20f以盐酸盐的形式析出，过滤、洗涤得白色固体粉末0.31g，收率91.4％：mp167.9-169.1℃；ESI-MS m/z [M+1]⁺ 320.3；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ9.49-9.46(d，1H，J＝7.2，8.60(brs，3H)，7.36-7.25(s，5H)，4.75-4.68(dd，1H，J＝13.5，8.7)，4.18-4.03(dd，2H，J＝27.6，17.4)，3.99(m，1H)，3.11-3.09(d，2H，J＝6.0)，3.08-2.99(dd，1H，J＝17.7，9.0)，2.53-2.45(dd，1H，J＝17.7，5.4)。

实施例7.(S)-2-氨基-N-((S)-(1-(2-(羟胺基)-2-氧乙基)-2，5-二氧吡咯-3-基)-3-苯基丙酰胺盐酸盐(22f)的制备

将0.2g盐酸羟胺混悬于1.5ml无水甲醇，缓慢加入0.5ml三乙胺，使氨基游离出来，溶液备用。

将2.0mmol羧酸衍生物19f溶解于20ml无水THF，控制溶液温度不高于-20℃，缓慢加入2e.q三乙胺，5min后缓慢加入1.01e.q氯甲酸异丁酯，出现白色浑浊说明制备混合酸酐的反应已经发生。反应液在-20℃搅拌15min，将上述含羟胺的甲醇溶液缓慢滴加至混合酸酐的反应液，约20min滴完。继续在-20℃保温反应15min，更换冷却液(冰浴)至0℃，搅拌反应，TLC检测反应进程。反应完毕后浓缩，加入30ml乙酸乙酯，先后用0.05％NaHCO3，5％柠檬酸，饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。将乙酸乙酯溶液过滤浓缩，得到类白色固体粉末无需纯化直接用于下部反应。

将上述化合物21f溶解于5ml 3N HCl-AcOEt，待完全溶解后，室温搅拌2-3小时，产物22f以盐酸盐的形式析出，过滤、洗涤得白色固体粉末0.34g，91.7％；mp 155.8-157.2℃；ESI-MSm/z [M+1]⁺ 335.3；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ10.70(s，1H)，9.46(brs，1H)，9.28-9.25(d，1H)，8.24(brs，3H)，7.06-7.04(d，2H，J＝8.4)，6.73-6.70(d，2H，J＝8.4)，4.82(m，1H)，4.48(m，1H)，4.31-4.22(m，2H)，3.15-3.09(m，1H)，2.95-2.88(m，2H)，2.77-2.62(m，1H)。

实施例8目标化合物抑制明胶酶活性试验(In vitro)

试验原理及详细步骤参见CN 1528745A吡咯烷类基质金属蛋白酶抑制剂及其制备方法。

实验结果见表一、表二。

实施例9目标化合物抑制氨肽酶N的活性试验(In vitro)

试验原理及详细步骤参见CN1974554A吡咯烷类基质金属蛋白酶抑制剂及其制备方法。

实验结果见表、表二。

实验结果表明：所有化合物均表现出较强的体外抑酶活性，除化合物6和20系列外，所有其他系列的大部分化合物对HL60细胞的抑制水平都达到或超过了阳性对照药乌苯美司的活性水平。其中化合物11a、11b、11e、13d、13e、13f和22d对APN和MMP-2的抑酶选择性也都达到或超过了阳性对照药乌苯美司的水平。

表一、化合物6，11，13体外抑酶试验结果

a表中数值为三次实验的平均值，“±”后数值表示标准偏差。

表二、化合物20和22体外抑酶试验结果

实施例10目标化合物抑制肿瘤细胞增殖试验(In vitro)

(1)试验原理：

抗肿瘤药物能不同程度的抑制肿瘤细胞的生长，从而达到抗肿瘤的目的，用肿瘤细胞系做体外试验，通过MTT法可以快速的检测化合物的抗肿瘤活性。

噻唑兰，简称MTT，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶性蓝紫色结晶Formazan并沉积在细胞内，二甲基亚砜能溶解此结晶物，用酶联免疫检测仪测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。MTT结晶物形成的量与活细胞数成正比，与死细胞无关。通过对比试验组与对照组光吸收值的变化可以反应化合物的抗肿瘤活性。

(2)试验材料：

细胞系：HL-60、ES-2、A549用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基，在5％CO₂浓度的CO₂培养箱中培养。

用品：一次性滤器，96孔板

MTT溶液：称取250mg MTT，放入小烧杯中，加入50ml PBS避光充分溶解。用0.22um的微孔滤器除菌。

受试化合物溶液的配置：

精确称取各化合物，用培养基溶解，过滤除菌备用。

试验步骤：

1、收集细胞，弃旧培养基，用新培养基重悬细胞。

2、细胞计数，HL-60细胞用培养基调整细胞至2×10⁵/ml；ES-2、A549细胞调整细胞至1×10⁵/ml。

3、传50μl细胞至96孔板中，将96孔板放入培养箱。

4、培养4h后，加入50μl不同浓度剃度的化合物，每个剃度3个复孔，对照组加入50μl培养基。

5、培养48h后，向96孔板中加入MTT溶液，10μl/孔。

6、培养4h后，离心弃培养基上清，向96孔板中加入100μl DMSO，充分溶解后，酶标仪检测570nm的吸光度值，630nm作参考波长。

数据处理：

根据吸光度值用下列公式计算出抑制率：

然后以抑制率为横坐标，浓度为纵坐标，利用半对数坐标纸求出各化合物的半数抑制浓度IC50值。

(3)试验结果：表三

*表中数值为三次实验的平均值，“±”后数值表示标准偏差

实验结果表明：化合物13d、13f和22f对HL60、ES-2和A549三种肿瘤细胞系的抑制活性都达到了阳性对照药乌苯美司的同一活性水平。

实施例11目标化合物抑制荷肝癌H22小鼠血道转移试验(体内试验)

具体方法以及操作步骤见CN 1528745A吡咯烷类基质金属蛋白酶抑制剂及其制备方法。

食用级羧甲基纤维素钠(CMC-Na)

表四、体内试验结果

^＊表示p＜0.05，^＊＊表示p＜0.01，^＊＊＊表示p＜0.001

数据处理时采用SPSS15.0软件，先对各组数据进行方差齐性检验(Test ofHomogeneity of Variances)，再采用One-Way ANOVA方法进行方差分析，分别采用LSD和SNK进行两两比较。

数据处理采用One-Way ANOVA方法比较组间差异时，各组体重与空白组均无显著性差异(p＜0.05)；各组肺重与空白组均无显著性差异(p＜0.05)；结节数均存在极显著性差异(p＜0.01)。与空白组比较，体重与肺重无显著性差异说明所合成的类肽抑制剂毒副作用较小；结节数明显减少说明所合成的类肽抑制剂显示了极好的体内抑制肿瘤转移活性。

Claims

1.具有通式I的类肽化合物及其药学上可接受的盐：

其中，

R₁是天然氨基酸的侧链，优选氢、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、酪氨酸或赖氨酸残基；

R₂是氢；

R₃是OH、OC₂H₅或NHOH；

n是1或2；

^*是立体构型为S或R光学纯度或其消旋体。

2.如权利要求1的化合物，其特征在于是下述化合物：

(S)-2-(3-(2-氨基乙酰胺基)-2，6-二氧哌啶-1-基)乙酸盐酸盐；

2-((S)-3-((S)-2-氨基丙酰胺基)-2，6-二氧哌啶-1-基)乙酸盐酸盐；

2-((S)-2，6-二氧-3-((S)-吡咯烷-2-羰酰胺基)哌啶-1-基)乙酸盐酸盐；

(S)-2-(3-(2-氨基乙酰胺基)-2，5-二氧氧吡咯-1-基)乙酸盐酸盐；

2-((S)-3-((S)-2-氨基丙酰胺基)-2，5-二氧吡咯-1-基)乙酸盐酸盐；

2-((S)-3-((S)-2-氨基4-甲基戊酰胺基)-2，5-二氧吡咯-1-基)乙酸盐酸盐；

3.制备权利要求1所述类肽化合物的中间体，其特征在于，是(S)-叔丁基2，6-二氧哌啶-3-基羰酰胺；(S)-乙基2-(3-(叔丁氧羰酰胺基)-2，6-二氧哌啶-1-基)乙酸酯；(S)-乙基2-(3-氨基)-2，6-二氧哌啶-1-基)乙酸酯；(S)-苄基-2-(3-(叔丁氧羰酰胺基)-2，6-二氧哌啶-1-基)乙酸酯；(S)-叔丁基2，5-2，5-二氧吡咯-3-基羰酰胺；(S)-苄基-2-(3-(叔丁氧羰酰胺基)-2，5-二氧吡咯-1-基)乙酸酯。

4.权利要求1所述类肽化合物的制备方法，其特征在于，以光学纯的谷胺酰胺或天冬酰胺为原料，通过Boc保护、环合、在相转移催化剂的条件下烷基化合成关键中间体，再通过与Boc保护的氨基酸衍生物以混合酸酐法得到不同系列的类二肽或类三肽，脱去苄酯保护得到羧基中间体再脱Boc保护或将羧基转化为其异羟肟酸衍生物再脱去Boc保护基得到氨基盐酸盐。

5.权利要求1或2的类肽化合物在制备用于预防或治疗与基质金属蛋白酶MMP和氨肽酶N活性异常表达相关的哺乳动物疾病的药物的应用，所述的与基质金属蛋白酶MMP和氨肽酶N活性异常表达的相关哺乳动物疾病包括：炎症，癌症，多发性硬化症，各种组织溃疡或组织溃疡性病症，牙周病，大疱性表皮松懈症，白血病。

6.一种药物组合物，包含(1)权利要求1或2的类肽化合物，和(2)一种或多种药学上可接受载体或赋形剂。

7.一种适于口服给予哺乳动物的药物组合物，包含(1)权利要求1或2的类肽化合物，和(2)药学上可接受载体，任选包含(3)一种或多种药学上可接受的赋形剂。

8.一种适于胃肠外给予哺乳动物的药物组合物，包含(1)权利要求1或2的类肽化合物，和(2)药学上可接受载体，任选包含(3)一种或多种药学上可接受的赋形剂。