CA2850609A1 - Procede de production de cellulases en continu par un champignon filamenteux utilisant un substrat carbone issu d'un pretraitement acide - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un procédé de production de cellulases et d'hémicellulases par une souche appartenant à un champignon filamenteux, en bioréacteur agité et aéré comprenant au moins deux phases, une phase a) de croissance de ladite souche en présence d'au moins un substrat carboné de croissance en réacteur fermé, ladite phase de croissance étant réalisée avec une concentration en substrat carboné de croissance comprise entre 10 et 90 g/L, une phase b) continue de production de cellulases dans laquelle au moins un substrat carboné inducteur est alimenté à un débit d'alimentation au moins constant pendant une durée au moins supérieure à 200h, ledit substrat carboné étant au moins une solution aqueuse d'hydrolysat hémicellulosique issu d'un prétraitement acide d'un substrat lignocellulosique, ladite solution aqueuse d'hydrolysat hémicellulosique ne subissant pas de stérilisation préalable et pas de rectification de pH, ledit pH de la solution aqueuse étant compris entre 0,5 et 3, la masse du volume réactionnel étant maintenu constant par soutirage d'une fraction dudit volume réactionnel, ladite phase b) opérant à un taux de dilution compris entre 0,001 et 0,02 h-1.
Description
PROCEDE DE PRODUCTION DE CELLULASES EN CONTINU PAR UN CHAMPIGNON FILAMENTEUX
UTILISANT UN SUBSTRAT CARBONE ISSU D'UN PRETRAITEMENT ACIDE
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne la production de cellulases et d'hémicellulases, notamment dans le cadre de la production d'éthanol à partir de matériaux ligno-cellulosiques. En particulier, la présente invention concerne un procédé de production de cellulase en continu à partir d'un champignon filamenteux.
ART ANTÉRIEUR
La mise au point de procédés économiquement viables de production de biocarburants de 2ème génération est aujourd'hui un vaste sujet d'actualité.
Ces derniers sont produits à partir de biomasse lignocellulosique et posent moins de problèmes de concurrence d'usage des terres agricoles avec l'alimentaire, par rapport aux biocarburants dits de première génération qui sont produits à
partir de canne à sucre, maïs, blé ou betterave.
La biomasse ligno-cellulosique se caractérise par une structure complexe constituée de trois principales fractions: la cellulose, les hémicelluloses et les lignines. De façon classique, le procédé de transformation en éthanol comprend plusieurs étapes.
Le prétraitement permet de rendre la cellulose accessible aux enzymes qui sont des cellulases. L'étape d'hydrolyse enzymatique permet la transformation de la cellulose en glucose qui est ensuite transformée en éthanol lors de l'étape de fermentation par, en général, la levure Saccharomyces cerevisiae. Enfin, l'étape de distillation va permettre de séparer et récupérer l'éthanol du moût de fermentation.
Les différentes études technico-économiques démontrent que la réduction du coût des cellulases est un des points-clés des procédés de production biologique d'éthanol à partir des matières premières lignocellulosiques. A l'heure actuelle, les cellulases industrielles sont principalement produites par un champignon filamenteux, Trichoderma reesei, en raison de son fort pouvoir de sécrétion.
Trichoderma reesei est le microorganisme le plus utilisé pour la production de cellulases. Les souches sauvages ont la faculté d'excréter, en présence d'un substrat inducteur, la cellulose par exemple, le cocktail enzymatique considéré comme le mieux adapté à l'hydrolyse de la cellulose. Les enzymes du cocktail enzymatique contiennent trois grands types d'activités : les endoglucanases, les exoglucanases et les cellobiases. D'autres protéines possédant des propriétés indispensables à
UTILISANT UN SUBSTRAT CARBONE ISSU D'UN PRETRAITEMENT ACIDE
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne la production de cellulases et d'hémicellulases, notamment dans le cadre de la production d'éthanol à partir de matériaux ligno-cellulosiques. En particulier, la présente invention concerne un procédé de production de cellulase en continu à partir d'un champignon filamenteux.
ART ANTÉRIEUR
La mise au point de procédés économiquement viables de production de biocarburants de 2ème génération est aujourd'hui un vaste sujet d'actualité.
Ces derniers sont produits à partir de biomasse lignocellulosique et posent moins de problèmes de concurrence d'usage des terres agricoles avec l'alimentaire, par rapport aux biocarburants dits de première génération qui sont produits à
partir de canne à sucre, maïs, blé ou betterave.
La biomasse ligno-cellulosique se caractérise par une structure complexe constituée de trois principales fractions: la cellulose, les hémicelluloses et les lignines. De façon classique, le procédé de transformation en éthanol comprend plusieurs étapes.
Le prétraitement permet de rendre la cellulose accessible aux enzymes qui sont des cellulases. L'étape d'hydrolyse enzymatique permet la transformation de la cellulose en glucose qui est ensuite transformée en éthanol lors de l'étape de fermentation par, en général, la levure Saccharomyces cerevisiae. Enfin, l'étape de distillation va permettre de séparer et récupérer l'éthanol du moût de fermentation.
Les différentes études technico-économiques démontrent que la réduction du coût des cellulases est un des points-clés des procédés de production biologique d'éthanol à partir des matières premières lignocellulosiques. A l'heure actuelle, les cellulases industrielles sont principalement produites par un champignon filamenteux, Trichoderma reesei, en raison de son fort pouvoir de sécrétion.
Trichoderma reesei est le microorganisme le plus utilisé pour la production de cellulases. Les souches sauvages ont la faculté d'excréter, en présence d'un substrat inducteur, la cellulose par exemple, le cocktail enzymatique considéré comme le mieux adapté à l'hydrolyse de la cellulose. Les enzymes du cocktail enzymatique contiennent trois grands types d'activités : les endoglucanases, les exoglucanases et les cellobiases. D'autres protéines possédant des propriétés indispensables à
2 l'hydrolyse des matériaux ligno-cellulosiques sont également produites par Trichoderma reesei, les xylanases par exemple. La présence d'un substrat inducteur est indispensable à l'expression des enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques.
La régulation des gènes de cellulases sur différentes sources de carbone a été
étudiée dans le détail. Elles sont induites en présence de cellulose, de ses produits d'hydrolyse (exemple: cellobiose) ou de certains oligosaccharides comme le lactose ou le sophorose (Ilmén et al., 1997; Appl.Environ. Microbiol. 63: 1298-1306).
Les techniques de génétique classique par mutation ont permis la sélection de souches de Trichoderma reesei hyperproductrices de cellulases telles que les souches MCG77 (Gallo - brevet US 4275 167), MCG 80 (Allen, A.L. et Andreotti, R.E., Biotechnol- Bioengi 1982, 12, 451-459 1982), RUT C30 (Montenecourt, B.S.
et Eveleigh, D.E., Appl. Environ. Microbiol. 1977, 34, 777-782) et CL847 (Durand et al, 1984, Proc. Colloque SFM "Génétique des microorganismes industriels". Paris.
H.
HESLOT Ed, pp 39-50).
Le procédé de production de cellulases par Trichoderma reesei a fait l'objet d'améliorations importantes en vue de l'extrapolation à l'échelle industrielle. La stratégie qui est appliquée industriellement est de faire une croissance rapide du champignon jusqu'à une concentration donnée dans une étape appelée phase de croissance dudit champignon, puis d'induire la production de cellulases à
partir dudit champignon afin de maximiser la productivité et le rendement dans une étape appelée phase et de production. Ladite phase de croissance est en général réalisé
dans un réacteur fermé, c'est-à-dire en mode "batch" selon la terminologie anglo-saxonne. Ladite phase de production, est en général réalisée dans un réacteur à
alimentation continue au cours de laquelle aucun soutirage du contenu du réacteur n'est effectué, c'est à dire en mode "fed batch" selon la terminologie anglo-saxonne.
Pour obtenir de bonnes productivités en enzymes, il est nécessaire d'apporter une source de carbone rapidement assimilable pour la croissance de Trichoderma reesei dans la phase de croissance et un substrat inducteur qui permette l'expression des cellulases et la sécrétion dans le milieu de culture dans la phase de production. La cellulose peut jouer ces deux rôles ; cependant, elle est difficile d'utilisation au stade industriel et a été remplacée par des sources de carbone solubles tel que le lactose, qui permet l'expression des cellulases. D'autres sucres solubles comme le cellobiose et le sophorose ont été décrits comme substrats inducteurs, mais ils sont trop onéreux pour être utilisés au stade industriel. Cependant, les productions de cellulases par Trichoderma reesei, avec des substrats solubles, sont très inférieures
La régulation des gènes de cellulases sur différentes sources de carbone a été
étudiée dans le détail. Elles sont induites en présence de cellulose, de ses produits d'hydrolyse (exemple: cellobiose) ou de certains oligosaccharides comme le lactose ou le sophorose (Ilmén et al., 1997; Appl.Environ. Microbiol. 63: 1298-1306).
Les techniques de génétique classique par mutation ont permis la sélection de souches de Trichoderma reesei hyperproductrices de cellulases telles que les souches MCG77 (Gallo - brevet US 4275 167), MCG 80 (Allen, A.L. et Andreotti, R.E., Biotechnol- Bioengi 1982, 12, 451-459 1982), RUT C30 (Montenecourt, B.S.
et Eveleigh, D.E., Appl. Environ. Microbiol. 1977, 34, 777-782) et CL847 (Durand et al, 1984, Proc. Colloque SFM "Génétique des microorganismes industriels". Paris.
H.
HESLOT Ed, pp 39-50).
Le procédé de production de cellulases par Trichoderma reesei a fait l'objet d'améliorations importantes en vue de l'extrapolation à l'échelle industrielle. La stratégie qui est appliquée industriellement est de faire une croissance rapide du champignon jusqu'à une concentration donnée dans une étape appelée phase de croissance dudit champignon, puis d'induire la production de cellulases à
partir dudit champignon afin de maximiser la productivité et le rendement dans une étape appelée phase et de production. Ladite phase de croissance est en général réalisé
dans un réacteur fermé, c'est-à-dire en mode "batch" selon la terminologie anglo-saxonne. Ladite phase de production, est en général réalisée dans un réacteur à
alimentation continue au cours de laquelle aucun soutirage du contenu du réacteur n'est effectué, c'est à dire en mode "fed batch" selon la terminologie anglo-saxonne.
Pour obtenir de bonnes productivités en enzymes, il est nécessaire d'apporter une source de carbone rapidement assimilable pour la croissance de Trichoderma reesei dans la phase de croissance et un substrat inducteur qui permette l'expression des cellulases et la sécrétion dans le milieu de culture dans la phase de production. La cellulose peut jouer ces deux rôles ; cependant, elle est difficile d'utilisation au stade industriel et a été remplacée par des sources de carbone solubles tel que le lactose, qui permet l'expression des cellulases. D'autres sucres solubles comme le cellobiose et le sophorose ont été décrits comme substrats inducteurs, mais ils sont trop onéreux pour être utilisés au stade industriel. Cependant, les productions de cellulases par Trichoderma reesei, avec des substrats solubles, sont très inférieures
3 à celles obtenues sur cellulose en mode "batch". Ceci est dû à l'effet répresseur des sucres facilement assimilables, à forte concentration.
L'alimentation en continu en mode "fed-batch" des substrats carbonés inducteurs solubles a permis de lever la répression catabolique en limitant la concentration résiduelle de substrat carboné dans les cultures et en optimisant la quantité
de sucre permettant d'obtenir un meilleur rendement et une meilleure productivité
enzymatique. Par exemple, le brevet FR-B-2 881 753 décrit un procédé de production de cellulases comprenant deux étapes :
Une phase de croissance en mode "batch" où il est nécessaire d'apporter une source de carbone rapidement assimilable pour la croissance de Trichoderma reesei puis - Une phase de production en mode "fed-batch" utilisant un substrat inducteur tel que par exemple le lactose qui permet l'expression des cellulases et la sécrétion dans le milieu de culture. L'alimentation en substrat carboné soluble se fait en continu, à un débit spécifique optimal appliqué, exprimé en mg de substrat par gramme en poids sec de champignon filamenteux et par heure, compris entre 35 et 45 mg. g-1. h-1.
Dans ce brevet, l'étape de production des protéines n'est pas mis en ceuvie au delà
d'environ 170 h. Ce protocole permet d'aboutir à une concentration en protéines de l'ordre de 35 à 40 g/L avec une productivité de l'ordre de 0,2 gr1.h-1.
Cependant, le réacteur doit être nettoyé et une nouvelle chaîne d'ensemencement doit être réalisée. L'inconvénient de ce mode opératoire est une productivité
trop faible qui fait augmenter l'investissement initial en nombre de fermenteurs de production d'enzymes. La concentration en protéines obtenue est également peu élevée et nécessite souvent une étape de concentration après filtration du mycellium.
Tout ceci contribue à rendre le procédé de production d'éthanol de deuxième génération peu compétitif.
Un objet de la présente invention est de fournir un procédé de production de cellulases et d'hémicellulases utilisant au moins un substrat carboné
inducteur spécifique issu du prétraitement acide d'un substrat lignocellulosique permettant d'augmenter voire de doubler la productivité et la concentration en cellulases et hémicellulases produites par rapport aux procédés de l'art antérieur, et de produire ces cellulases en continu pendant une durée accrue. Le procédé selon la présente invention permet d'augmenter voire de doubler la productivité et la concentration en cellulases et hémicellulases produites tout en maintenant le rendement de production
L'alimentation en continu en mode "fed-batch" des substrats carbonés inducteurs solubles a permis de lever la répression catabolique en limitant la concentration résiduelle de substrat carboné dans les cultures et en optimisant la quantité
de sucre permettant d'obtenir un meilleur rendement et une meilleure productivité
enzymatique. Par exemple, le brevet FR-B-2 881 753 décrit un procédé de production de cellulases comprenant deux étapes :
Une phase de croissance en mode "batch" où il est nécessaire d'apporter une source de carbone rapidement assimilable pour la croissance de Trichoderma reesei puis - Une phase de production en mode "fed-batch" utilisant un substrat inducteur tel que par exemple le lactose qui permet l'expression des cellulases et la sécrétion dans le milieu de culture. L'alimentation en substrat carboné soluble se fait en continu, à un débit spécifique optimal appliqué, exprimé en mg de substrat par gramme en poids sec de champignon filamenteux et par heure, compris entre 35 et 45 mg. g-1. h-1.
Dans ce brevet, l'étape de production des protéines n'est pas mis en ceuvie au delà
d'environ 170 h. Ce protocole permet d'aboutir à une concentration en protéines de l'ordre de 35 à 40 g/L avec une productivité de l'ordre de 0,2 gr1.h-1.
Cependant, le réacteur doit être nettoyé et une nouvelle chaîne d'ensemencement doit être réalisée. L'inconvénient de ce mode opératoire est une productivité
trop faible qui fait augmenter l'investissement initial en nombre de fermenteurs de production d'enzymes. La concentration en protéines obtenue est également peu élevée et nécessite souvent une étape de concentration après filtration du mycellium.
Tout ceci contribue à rendre le procédé de production d'éthanol de deuxième génération peu compétitif.
Un objet de la présente invention est de fournir un procédé de production de cellulases et d'hémicellulases utilisant au moins un substrat carboné
inducteur spécifique issu du prétraitement acide d'un substrat lignocellulosique permettant d'augmenter voire de doubler la productivité et la concentration en cellulases et hémicellulases produites par rapport aux procédés de l'art antérieur, et de produire ces cellulases en continu pendant une durée accrue. Le procédé selon la présente invention permet d'augmenter voire de doubler la productivité et la concentration en cellulases et hémicellulases produites tout en maintenant le rendement de production
4 de cellulases par rapport au substrat carboné utilisé constant par rapport aux procédés de l'art antérieur.
RÉSUMÉ ET INTÉRET DE L'INVENTION
La présente invention concerne un procédé de production de cellulases et hémicellulases par une souche appartenant à un champignon filamenteux, en, bioréacteur agité et aéré comprenant au moins deux phases :
- une phase a) de croissance de ladite souche en présence d'au moins un substrat carboné de croissance en réacteur fermé, ladite phase de croissance étant réalisée avec une concentration en substrat carboné de croissance comprise entre 10 et g/L
- une phase b) continue de production de cellulases dans laquelle au moins un substrat carboné inducteur est alimenté à un débit d'alimentation au moins constant pendant une durée au moins supérieure à 200h, ledit substrat carboné inducteur étant au moins une solution aqueuse d'hydrolysat hémicellulosique issu d'un prétraitement acide d'un substrat lignocellulosique, ladite solution aqueuse d'hydrolysat hémicellulosique ne subissant pas de stérilisation préalable et pas de rectification de pH, ledit pH de la solution aqueuse étant compris entre 0,5 et 3, la masse du volume réactionnel étant maintenu constant par soutirage d'une fraction dudit volume réactionnel, ladite phase b) opérant à un taux de dilution compris entre 0,001 et 0,02 h-1.
Avantage de l'invention Un avantage de la présente invention est de permettre d'améliorer la productivité et la concentration en protéines produites sur une durée de fonctionnement accrue. En particulier, le procédé selon l'invention permet l'obtention d'une concentration en protéines supérieure à 100g.L-1. Ces performances ont été maintenues expérimentalement en mode continu pendant plus de 400 h.
La forte productivité obtenue permet de réduire les coûts d'investissements en bioréacteur. La durée prolongée permet de réduire le temps consacré au nettoyage des bioréacteurs et aux chaines d'ensemencement. La forte concentration en cellulases permet de réduire les coûts de post-traitement.
RÉSUMÉ ET INTÉRET DE L'INVENTION
La présente invention concerne un procédé de production de cellulases et hémicellulases par une souche appartenant à un champignon filamenteux, en, bioréacteur agité et aéré comprenant au moins deux phases :
- une phase a) de croissance de ladite souche en présence d'au moins un substrat carboné de croissance en réacteur fermé, ladite phase de croissance étant réalisée avec une concentration en substrat carboné de croissance comprise entre 10 et g/L
- une phase b) continue de production de cellulases dans laquelle au moins un substrat carboné inducteur est alimenté à un débit d'alimentation au moins constant pendant une durée au moins supérieure à 200h, ledit substrat carboné inducteur étant au moins une solution aqueuse d'hydrolysat hémicellulosique issu d'un prétraitement acide d'un substrat lignocellulosique, ladite solution aqueuse d'hydrolysat hémicellulosique ne subissant pas de stérilisation préalable et pas de rectification de pH, ledit pH de la solution aqueuse étant compris entre 0,5 et 3, la masse du volume réactionnel étant maintenu constant par soutirage d'une fraction dudit volume réactionnel, ladite phase b) opérant à un taux de dilution compris entre 0,001 et 0,02 h-1.
Avantage de l'invention Un avantage de la présente invention est de permettre d'améliorer la productivité et la concentration en protéines produites sur une durée de fonctionnement accrue. En particulier, le procédé selon l'invention permet l'obtention d'une concentration en protéines supérieure à 100g.L-1. Ces performances ont été maintenues expérimentalement en mode continu pendant plus de 400 h.
La forte productivité obtenue permet de réduire les coûts d'investissements en bioréacteur. La durée prolongée permet de réduire le temps consacré au nettoyage des bioréacteurs et aux chaines d'ensemencement. La forte concentration en cellulases permet de réduire les coûts de post-traitement.
5 Un autre avantage du procédé continu selon l'invention est qu'il nécessite un faible Ka du fait, à la fois de l'application d'un faible taux de dilution dans la phase b) continue de production et de l'utilisation d'une solution de substrat carboné
inducteur spécifique dans ladite phase b), ce qui permet de maintenir une faible viscosité dans 5 le milieu réactionnel.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTION
Le procédé selon l'invention opère de préférence à un pH compris entre 3 et 6, à une température comprise entre 20 et 35 C, à une vvm, c'est-à-dire à un taux d'aération exprimé en volume d'air, dans les conditions normales de température et de pression, par volume de milieu réactionnel et par minute comprise entre 0,3 et 1,5 min-1, de préférence entre 0,3 et 1 min-1 et avec une agitation permettant d'obtenir une pression partielle en oxygène dans le milieu réactionnel comprise entre 20% et 60% et de préférence comprise entre 20 et 40%.
De préférence, le procédé selon l'invention opère à une vvm de 0.5 min-1 et avec une agitation permettant de réguler la pression partielle en oxygène à 30 %.
Conformément à l'invention, ledit procédé comprend une phase a) de croissance de la souche appartenant à un champignon filamenteux, de préférence le champignon Trichoderma reesei, en présence d'au moins un substrat carboné de croissance en réacteur fermé, ladite phase de croissance étant réalisée avec une concentration en substrat carboné de croissance comprise entre 10 et 90 g/L.
Ladite souche mise en oeuvre dans le procédé selon l'invention est une souche d'un champignon filamenteux appartenant de préférence aux genres Trichoderma, Aspergillus, Penicillium ou Schizophyllum, et de manière préférée ladite souche appartient à l'espèce Trichoderma reesei.
La souche utilisée appartenant de préférence à l'espèce Trichoderma reesei, peut avantageusement être modifiée pour améliorer les enzymes cellulolytiques et/ou hémiceliulolytiques par des procédés de mutation-sélection, comme par exemple la souche IFP CL847. Une souche améliorée par les techniques de recombinaison génétique peut également être utilisée. Ladite souche est cultivée en réacteurs agités et aérés dans des conditions compatibles avec sa croissance et la production
inducteur spécifique dans ladite phase b), ce qui permet de maintenir une faible viscosité dans 5 le milieu réactionnel.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTION
Le procédé selon l'invention opère de préférence à un pH compris entre 3 et 6, à une température comprise entre 20 et 35 C, à une vvm, c'est-à-dire à un taux d'aération exprimé en volume d'air, dans les conditions normales de température et de pression, par volume de milieu réactionnel et par minute comprise entre 0,3 et 1,5 min-1, de préférence entre 0,3 et 1 min-1 et avec une agitation permettant d'obtenir une pression partielle en oxygène dans le milieu réactionnel comprise entre 20% et 60% et de préférence comprise entre 20 et 40%.
De préférence, le procédé selon l'invention opère à une vvm de 0.5 min-1 et avec une agitation permettant de réguler la pression partielle en oxygène à 30 %.
Conformément à l'invention, ledit procédé comprend une phase a) de croissance de la souche appartenant à un champignon filamenteux, de préférence le champignon Trichoderma reesei, en présence d'au moins un substrat carboné de croissance en réacteur fermé, ladite phase de croissance étant réalisée avec une concentration en substrat carboné de croissance comprise entre 10 et 90 g/L.
Ladite souche mise en oeuvre dans le procédé selon l'invention est une souche d'un champignon filamenteux appartenant de préférence aux genres Trichoderma, Aspergillus, Penicillium ou Schizophyllum, et de manière préférée ladite souche appartient à l'espèce Trichoderma reesei.
La souche utilisée appartenant de préférence à l'espèce Trichoderma reesei, peut avantageusement être modifiée pour améliorer les enzymes cellulolytiques et/ou hémiceliulolytiques par des procédés de mutation-sélection, comme par exemple la souche IFP CL847. Une souche améliorée par les techniques de recombinaison génétique peut également être utilisée. Ladite souche est cultivée en réacteurs agités et aérés dans des conditions compatibles avec sa croissance et la production
6 de cellulases. D'autres souches de microorganismes produisant des cellulases selon des processus similaires à ceux utilisés pour Trichoderma peuvent être utilisées.
De manière très préférée, la souche utilisée est une souche de Trichoderma reesei modifiée par mutation, sélection ou recombinaison génétique.
La souche peut avantageusement être choisie parmi les souches CL847, RutC30, MCG77, ou MCG80.
Le substrat carboné de croissance utilisé dans ladite phase de croissance est avantageusement choisi parmi les sucres solubles industriels, et de préférence parmi le glucose, le lactose, le xylose, les résidus obtenus après fermentation éthanolique des sucres monomères des hydrolysats enzymatiques de substrat lignocellulosique et les extraits de la fraction hémicellulosique sous forme de monomères provenant de substrat lignocellulosique prétraité, utilisé seul ou en mélange.
Selon sa nature, ledit substrat carboné est avantageusement introduit dans le réacteur avant stérilisation dudit réacteur ou est stérilisé séparément et introduit dans le réacteur préalablement stérilisé.
De préférence, la concentration en substrat carboné de croissance est comprise entre 30 et 70 g/L.
De préférence, la phase a) de croissance est réalisée sur une durée comprise entre et 70h et de préférence entre 40 et 60h.
De préférence, la phase a) de croissance opère à un pH de 4,8 et à une température de 27 C.
25 Conformément à l'invention, ledit procédé comprend une phase b) continue de production de cellulases dans laquelle au moins un substrat carboné inducteur est alimenté à un débit d'alimentation au moins constant, pendant une durée au moins supérieure à 200h, ledit substrat carboné étant au moins une solution aqueuse d'hydrolysat hémicellulosique issu d'un prétraitement acide d'un substrat 30 lignocellulosique, ladite solution aqueuse d'hydrolysat hémicellulosique ne subissant pas de stérilisation préalable et pas de rectification de pH, ledit pH de la solution aqueuse étant compris entre 0,5 et 3, la masse du volume réactionnel étant maintenu constant par soutirage d'une fraction dudit volume réactionnel, ladite phase b) opérant à un taux de dilution compris entre 0,001 et 0,02 h-1.
De manière très préférée, la souche utilisée est une souche de Trichoderma reesei modifiée par mutation, sélection ou recombinaison génétique.
La souche peut avantageusement être choisie parmi les souches CL847, RutC30, MCG77, ou MCG80.
Le substrat carboné de croissance utilisé dans ladite phase de croissance est avantageusement choisi parmi les sucres solubles industriels, et de préférence parmi le glucose, le lactose, le xylose, les résidus obtenus après fermentation éthanolique des sucres monomères des hydrolysats enzymatiques de substrat lignocellulosique et les extraits de la fraction hémicellulosique sous forme de monomères provenant de substrat lignocellulosique prétraité, utilisé seul ou en mélange.
Selon sa nature, ledit substrat carboné est avantageusement introduit dans le réacteur avant stérilisation dudit réacteur ou est stérilisé séparément et introduit dans le réacteur préalablement stérilisé.
De préférence, la concentration en substrat carboné de croissance est comprise entre 30 et 70 g/L.
De préférence, la phase a) de croissance est réalisée sur une durée comprise entre et 70h et de préférence entre 40 et 60h.
De préférence, la phase a) de croissance opère à un pH de 4,8 et à une température de 27 C.
25 Conformément à l'invention, ledit procédé comprend une phase b) continue de production de cellulases dans laquelle au moins un substrat carboné inducteur est alimenté à un débit d'alimentation au moins constant, pendant une durée au moins supérieure à 200h, ledit substrat carboné étant au moins une solution aqueuse d'hydrolysat hémicellulosique issu d'un prétraitement acide d'un substrat 30 lignocellulosique, ladite solution aqueuse d'hydrolysat hémicellulosique ne subissant pas de stérilisation préalable et pas de rectification de pH, ledit pH de la solution aqueuse étant compris entre 0,5 et 3, la masse du volume réactionnel étant maintenu constant par soutirage d'une fraction dudit volume réactionnel, ladite phase b) opérant à un taux de dilution compris entre 0,001 et 0,02 h-1.
7 Ladite phase continue est avantageusement réalisée dans un réacteur à
alimentation continue au cours de laquelle une fraction du volume réactionnel est soutirée de manière à maintenir la masse du volume réactionnel constante. Ladite phase continue est appelé mode "chemostat" selon la terminologie anglo-saxonne.
Le substrat lignocellulosique permettant d'obtenir la solution aqueuse d'hydrolysat hémicellulosique utilisée dans la phase b) du procédé selon l'invention est une source d'hydrates de carbones composée de trois principaux constituants : la cellulose (35 à 50%), les hémicelluloses (20 à 30%) qui sont des polysaccharides essentiellement constitués de pentoses et d'hexoses et la lignine (15 à 25%) qui est une macromolécule de structure complexe et de haut poids moléculaire, composé
d'alcools aromatiques reliés par des liaisons éther. Ledit substrat est avantageusement choisi parmi les pailles, le bois, les cultures forestières, les résidus de plantes alcooligènes, sucrières et céréalières, les résidus de l'industrie papetière et les produits de transformation des matériaux lignocellulosique.
Le prétraitement acide subi par ledit substrat lignocellulosique est mis en oeuvre selon les prétraitements acides connus de l'homme du métier. De préférence, le prétraitement acide est une hydrolyse acide, une cuisson acide ou une explosion à la vapeur avec imprégnation préalable dudit substrat lignocellulosique avec une solution aqueuse d'acide sulfurique.
La solution aqueuse d'hydrolysat hémicellulosique ainsi obtenue présente un pH
compris entre 0,5 et 3 et est utilisée sans étape de stérilisation ni de rectification du pH.
De préférence, ladite solution aqueuse d'hydrolysat hémicellulosique présente un pH
compris entre 0,5 et 2.
Le substrat carboné inducteur utilisé dans la phase b) du procédé selon l'invention est avantageusement une solution aqueuse d'hydrolysat hémicellulosique issu d'un prétraitement acide d'un substrat lignocellulosique seule ou en mélange avec au moins un autre substrat carboné n'ayant pas subi de stérilisation.
De préférence, lesdits substrats carbonés sont choisis parmi des sucres inducteurs ou non inducteurs, de manière préférée choisis parmi le lactose, le glucose, le cellobiose et le xylose, pris seuls ou en mélange.
alimentation continue au cours de laquelle une fraction du volume réactionnel est soutirée de manière à maintenir la masse du volume réactionnel constante. Ladite phase continue est appelé mode "chemostat" selon la terminologie anglo-saxonne.
Le substrat lignocellulosique permettant d'obtenir la solution aqueuse d'hydrolysat hémicellulosique utilisée dans la phase b) du procédé selon l'invention est une source d'hydrates de carbones composée de trois principaux constituants : la cellulose (35 à 50%), les hémicelluloses (20 à 30%) qui sont des polysaccharides essentiellement constitués de pentoses et d'hexoses et la lignine (15 à 25%) qui est une macromolécule de structure complexe et de haut poids moléculaire, composé
d'alcools aromatiques reliés par des liaisons éther. Ledit substrat est avantageusement choisi parmi les pailles, le bois, les cultures forestières, les résidus de plantes alcooligènes, sucrières et céréalières, les résidus de l'industrie papetière et les produits de transformation des matériaux lignocellulosique.
Le prétraitement acide subi par ledit substrat lignocellulosique est mis en oeuvre selon les prétraitements acides connus de l'homme du métier. De préférence, le prétraitement acide est une hydrolyse acide, une cuisson acide ou une explosion à la vapeur avec imprégnation préalable dudit substrat lignocellulosique avec une solution aqueuse d'acide sulfurique.
La solution aqueuse d'hydrolysat hémicellulosique ainsi obtenue présente un pH
compris entre 0,5 et 3 et est utilisée sans étape de stérilisation ni de rectification du pH.
De préférence, ladite solution aqueuse d'hydrolysat hémicellulosique présente un pH
compris entre 0,5 et 2.
Le substrat carboné inducteur utilisé dans la phase b) du procédé selon l'invention est avantageusement une solution aqueuse d'hydrolysat hémicellulosique issu d'un prétraitement acide d'un substrat lignocellulosique seule ou en mélange avec au moins un autre substrat carboné n'ayant pas subi de stérilisation.
De préférence, lesdits substrats carbonés sont choisis parmi des sucres inducteurs ou non inducteurs, de manière préférée choisis parmi le lactose, le glucose, le cellobiose et le xylose, pris seuls ou en mélange.
8 Lesdits substrats sont dissouts dans ladite solution aqueuse d'hydrolysat hémicellulosique.
Dans le cas où le substrat carboné inducteur est une solution aqueuse d'hydrolysat hémicellulosique issu d'un prétraitement acide d'un substrat lignocellulosique en mélange avec au moins un autre substrat carboné n'ayant pas subi de stérilisation, ledit substrat carboné inducteur présente une concentration comprise entre 200 et 600 g/L selon le degré de solubilité des substrats carbonés utilisés.
Dans le cas où le substrat carboné inducteur est une solution aqueuse d'hydrolysat hémicellulosique issu d'un prétraitement acide d'un substrat lignocellulosique seule, ledit substrat carboné inducteur présente une concentration comprise entre 40 et 400 g/L après avoir éventuellement été concentrée.
L'utilisation dudit substrat carboné inducteur spécifique issu du prétraitement acide d'un substrat lignocellulosique permet la mise en oeuvre de la phase b) de production de cellulases sur une durée accrue, de préférence supérieure à 200h, par rapport aux procédé de l'art antérieur.
Conformément à l'invention, ledit substrat carboné inducteur est alimenté à un débit d'alimentation au moins constant. De préférence, le débit d'alimentation dudit substrat carboné inducteur est compris entre 35 et 140 et de préférence entre 35 et 60 mg de substrat carboné inducteur par gramme en poids sec de souche et par heure.
De manière préférée, le débit d'alimentation est graduellement augmenté dans la phase b), de manière plus préférée graduellement augmenté jusqu'à être doublé
dans les premières heures de mise en oeuvre de la phase b), de préférence après au moins 24h et de manière préférée après au moins 48h de mise en oeuvre de la phase b).
Conformément à l'invention, la durée de la phase b) continue de production de cellulases est au moins supérieure à 200h, de préférence au moins supérieure à
300h et de manière préféré au moins supérieure à 400h.
Dans la phase b), la masse du volume réactionnel est maintenue constante par soutirage d'une fraction dudit volume réactionnel.
Dans le cas où le substrat carboné inducteur est une solution aqueuse d'hydrolysat hémicellulosique issu d'un prétraitement acide d'un substrat lignocellulosique en mélange avec au moins un autre substrat carboné n'ayant pas subi de stérilisation, ledit substrat carboné inducteur présente une concentration comprise entre 200 et 600 g/L selon le degré de solubilité des substrats carbonés utilisés.
Dans le cas où le substrat carboné inducteur est une solution aqueuse d'hydrolysat hémicellulosique issu d'un prétraitement acide d'un substrat lignocellulosique seule, ledit substrat carboné inducteur présente une concentration comprise entre 40 et 400 g/L après avoir éventuellement été concentrée.
L'utilisation dudit substrat carboné inducteur spécifique issu du prétraitement acide d'un substrat lignocellulosique permet la mise en oeuvre de la phase b) de production de cellulases sur une durée accrue, de préférence supérieure à 200h, par rapport aux procédé de l'art antérieur.
Conformément à l'invention, ledit substrat carboné inducteur est alimenté à un débit d'alimentation au moins constant. De préférence, le débit d'alimentation dudit substrat carboné inducteur est compris entre 35 et 140 et de préférence entre 35 et 60 mg de substrat carboné inducteur par gramme en poids sec de souche et par heure.
De manière préférée, le débit d'alimentation est graduellement augmenté dans la phase b), de manière plus préférée graduellement augmenté jusqu'à être doublé
dans les premières heures de mise en oeuvre de la phase b), de préférence après au moins 24h et de manière préférée après au moins 48h de mise en oeuvre de la phase b).
Conformément à l'invention, la durée de la phase b) continue de production de cellulases est au moins supérieure à 200h, de préférence au moins supérieure à
300h et de manière préféré au moins supérieure à 400h.
Dans la phase b), la masse du volume réactionnel est maintenue constante par soutirage d'une fraction dudit volume réactionnel.
9 De préférence, le soutirage est réalisé selon les méthodes de soutirage connues de l'homme du métier telles que par exemple grâce à un système de régulation et à
une pompe de soutirage commandable.
De préférence, le débit de soutirage est au moins égal au débit d'alimentation dans la phase b).
Conformément à l'invention, le taux de dilution, défini comme le ratio du débit de soutirage sur le volume réactionnel du réacteur lors de la phase b) continue de production, est avantageusement compris entre 0,001h-1 et 0,02 h-1 et de manière préférée entre 0,002 et 0,008h-1. Le taux de dilution très préféré est de 0,004 h-1.
De préférence, la phase b) opère à un pH compris entre 3 et 5,5 et à une température comprise entre 20 et 30 C.
Une phase optionnelle a') de production réalisée dans un réacteur à
alimentation continue d'au moins un substrat carboné inducteur, au cours de laquelle aucun soutirage du contenu du fermenteur n'est effectué, c'est à dire en mode "fed batch", est avantageusement mise en oeuvre entre la phase a) et la phase b).
La mise en oeuvre de ladite phase a') permet de ne pas soutirer de fraction du volume réactionnel contenant la souche de champignon filamenteux alors que les concentrations en protéines produites sont encore faibles.
Ledit substrat carboné inducteur utilisé dans la phase a') est identique au substrat carboné inducteur utilisé dans la phase b) de production.
De préférence, le débit d'alimentation dudit substrat carboné inducteur est compris entre 35 et 140 et de préférence entre 35 et 60 mg de substrat carboné
inducteur par gramme en poids sec de souche et par heure. Ledit débit d'alimentation est maintenu constant pendant toute la durée de la phase a').
De préférence, la phase a') est mise en oeuvre pendant une durée comprise entre 50 et 150 h et de préférence entre 70 et 130h.
De préférence, la phase a') opère à un pH compris entre 3 et 5,5 et à une température comprise entre 20 et 30 C.
Le procédé selon la présente invention permet d'augmenter voire de doubler la productivité ainsi que la concentration en cellulases et hémicellulases produites par rapport aux procédés de l'art antérieur, et de produire ces cellulases en continu pendant une durée accrue.
EXEMPLES
5 Exemple 1 : non conforme L'exemple 1 présente une culture utilisant les conditions de référence du brevet FR-B-2 881 753. L'exemple 1 illustre un procédé de production de cellulases et hémicellulases comportant une phase de croissance et une phase de production en mode "fed batch" mise en uvre pendant 167 h
une pompe de soutirage commandable.
De préférence, le débit de soutirage est au moins égal au débit d'alimentation dans la phase b).
Conformément à l'invention, le taux de dilution, défini comme le ratio du débit de soutirage sur le volume réactionnel du réacteur lors de la phase b) continue de production, est avantageusement compris entre 0,001h-1 et 0,02 h-1 et de manière préférée entre 0,002 et 0,008h-1. Le taux de dilution très préféré est de 0,004 h-1.
De préférence, la phase b) opère à un pH compris entre 3 et 5,5 et à une température comprise entre 20 et 30 C.
Une phase optionnelle a') de production réalisée dans un réacteur à
alimentation continue d'au moins un substrat carboné inducteur, au cours de laquelle aucun soutirage du contenu du fermenteur n'est effectué, c'est à dire en mode "fed batch", est avantageusement mise en oeuvre entre la phase a) et la phase b).
La mise en oeuvre de ladite phase a') permet de ne pas soutirer de fraction du volume réactionnel contenant la souche de champignon filamenteux alors que les concentrations en protéines produites sont encore faibles.
Ledit substrat carboné inducteur utilisé dans la phase a') est identique au substrat carboné inducteur utilisé dans la phase b) de production.
De préférence, le débit d'alimentation dudit substrat carboné inducteur est compris entre 35 et 140 et de préférence entre 35 et 60 mg de substrat carboné
inducteur par gramme en poids sec de souche et par heure. Ledit débit d'alimentation est maintenu constant pendant toute la durée de la phase a').
De préférence, la phase a') est mise en oeuvre pendant une durée comprise entre 50 et 150 h et de préférence entre 70 et 130h.
De préférence, la phase a') opère à un pH compris entre 3 et 5,5 et à une température comprise entre 20 et 30 C.
Le procédé selon la présente invention permet d'augmenter voire de doubler la productivité ainsi que la concentration en cellulases et hémicellulases produites par rapport aux procédés de l'art antérieur, et de produire ces cellulases en continu pendant une durée accrue.
EXEMPLES
5 Exemple 1 : non conforme L'exemple 1 présente une culture utilisant les conditions de référence du brevet FR-B-2 881 753. L'exemple 1 illustre un procédé de production de cellulases et hémicellulases comportant une phase de croissance et une phase de production en mode "fed batch" mise en uvre pendant 167 h
10 La production de cellulases et hémicellulases est effectuée en réacteur agité
mécaniquement de 3 L. Le milieu minéral a la composition suivante : KOH 1,66 g./L, H3PO4 85 % 2 ml/L, (NH4)2SO4 2,8 g/L, MgSO4, 7 H20 0,6 g/L, CaCL2 0,6 g/L, MnSO4 3,2 mg/L, ZnSO4, 7 H20 2,8 mg/L, CoCl2 10 4,0 mg/L, FeSO4, 7 H20 10 mg/L, Corn Steep 1,2 g/L, anti-mousse 0,5 mL/L.
Une préculture liquide de la souche de Trichoderma reesei CL847 est réalisée.
Le milieu minéral de la préculture, est identique à celui du réacteur mis à part l'addition de phtalate de potassium à 5 g/L pour tamponner le pH. La croissance du champignon en préculture est faite en utilisant le glucose comme substrat carboné, à
la concentration de 30 g.L-1. La croissance de l'inoculum dure de 2 à 3 jours et est effectuée à 28 C dans un incubateur agité à pression atmosphérique.
Le réacteur contenant le milieu minéral est stérilisé à 120 C pendant 20 minutes, la source carbonée glucose est stérilisée à part à 120 C pendant 20 minutes puis ajoutée stérilement dans le réacteur de façon à avoir une concentration finale de 30 g/L. Le réacteur est ensemencé à 10% (v/v) avec ladite préculture liquide de la souche de Trichoderma reesei CL847 dès que la concentration résiduelle en glucose dans la préculture est inférieure à 15 g/L.
L'expérience effectuée en bioréacteur comporte deux phases :
- Une phase de croissance sur substrat carboné glucose (concentration initiale = 30 g/L) à une température de 27 C et un pH de 4,8 (régulé par de l'ammoniaque 5,5 M). L'aération est de 0,5 vvm et l'agitation est augmentée entre 200 et 800 rpm en fonction de la p02 (pression en oxygène dissous), qui est régulée à 30 %.
-Une phase de production de protéines en mode "fed batch". Après 30 heure, une solution de substrat carboné lactose à 250 g.L-1 est injectée en continu au débit de 4 mL/h soit à 35 mg de lactose par g de souche de Trichoderma reesei CL847 et par
mécaniquement de 3 L. Le milieu minéral a la composition suivante : KOH 1,66 g./L, H3PO4 85 % 2 ml/L, (NH4)2SO4 2,8 g/L, MgSO4, 7 H20 0,6 g/L, CaCL2 0,6 g/L, MnSO4 3,2 mg/L, ZnSO4, 7 H20 2,8 mg/L, CoCl2 10 4,0 mg/L, FeSO4, 7 H20 10 mg/L, Corn Steep 1,2 g/L, anti-mousse 0,5 mL/L.
Une préculture liquide de la souche de Trichoderma reesei CL847 est réalisée.
Le milieu minéral de la préculture, est identique à celui du réacteur mis à part l'addition de phtalate de potassium à 5 g/L pour tamponner le pH. La croissance du champignon en préculture est faite en utilisant le glucose comme substrat carboné, à
la concentration de 30 g.L-1. La croissance de l'inoculum dure de 2 à 3 jours et est effectuée à 28 C dans un incubateur agité à pression atmosphérique.
Le réacteur contenant le milieu minéral est stérilisé à 120 C pendant 20 minutes, la source carbonée glucose est stérilisée à part à 120 C pendant 20 minutes puis ajoutée stérilement dans le réacteur de façon à avoir une concentration finale de 30 g/L. Le réacteur est ensemencé à 10% (v/v) avec ladite préculture liquide de la souche de Trichoderma reesei CL847 dès que la concentration résiduelle en glucose dans la préculture est inférieure à 15 g/L.
L'expérience effectuée en bioréacteur comporte deux phases :
- Une phase de croissance sur substrat carboné glucose (concentration initiale = 30 g/L) à une température de 27 C et un pH de 4,8 (régulé par de l'ammoniaque 5,5 M). L'aération est de 0,5 vvm et l'agitation est augmentée entre 200 et 800 rpm en fonction de la p02 (pression en oxygène dissous), qui est régulée à 30 %.
-Une phase de production de protéines en mode "fed batch". Après 30 heure, une solution de substrat carboné lactose à 250 g.L-1 est injectée en continu au débit de 4 mL/h soit à 35 mg de lactose par g de souche de Trichoderma reesei CL847 et par
11 heure jusqu'à 167 heures. La température est baissée à 25 C et le pH à 4 jusqu'à la fin de la culture. Le pH est régulé par addition d'une solution d'ammoniaque à
5,5 N
qui apporte l'azote nécessaire à la synthèse des cellulases et hémicellulases excrétées. La teneur en oxygène dissous est maintenue à 30 h par action de l'agitation La production de cellulases est suivie par le dosage des protéines extracellulaires par la méthode de Lowry et standard BSA, après séparation du mycélium par filtration ou centrifugation. Les activités cellulolytiques déterminées sont:
- L'activité papier filtre (UPF : unité papier filtre) qui permet de doser l'activité
globale du pool enzymatique endoglucanases et exoglucanases - L'activité 8-glucosidase pour les activités spécifiques.
L'activité UPF est mesurée sur papier Whatman n 1 selon la procédure recommandée par la commission biotechnologique IUPAC, à la concentration initiale de 50 grl ; on détermine la prise d'essai de la solution enzymatique à
analyser qui libère l'équivalent de 2 g.1-1 de glucose (dosage colorimétrique) en 60 minutes. Le principe de l'activité papier filtre est de déterminer par dosage à l'acide dinitrosalicylique (DNS) la quantité de sucres réduits issue d'un papier Whatman N 1.
Le substrat utilisé pour déterminer l'activité 8-glucosidase est le p-nitropheny141-D-glucopyranoside (PNPG). Il est clivé par la fi-glucosidase qui libère le p-nitrophenol.
Une unité d'activité p-glucosidase est définie comme la quantité d'enzyme nécessaire pour produire 1pmol de nitrophenol à partir de PNPG par minute et est exprimée en IU/ml.
Les activités spécifiques sont obtenues en divisant les activités exprimées en IU/mL
par la concentration en cellulases. Elles sont exprimées en IU.mg-1.
La productivité finale est calculée en tenant compte de toute la masse des cellulases et hémicellulases produites durant la phase de production (incluant les prélèvements) et en la divisant par la durée de la phase de production et le volume utile du réacteur.
Le terme "Biomasse" caractérise la souche de Trichoderma reesei CL847.
Le terme "Protéine" est défini comme étant le cocktail enzymatique obtenu comprenant les cellulases et hémicellulases produites.
Les déterminations analytiques sur le moût final de l'exemple 1 donnent les résultats suivants :
Biomasse g/I : 14,4
5,5 N
qui apporte l'azote nécessaire à la synthèse des cellulases et hémicellulases excrétées. La teneur en oxygène dissous est maintenue à 30 h par action de l'agitation La production de cellulases est suivie par le dosage des protéines extracellulaires par la méthode de Lowry et standard BSA, après séparation du mycélium par filtration ou centrifugation. Les activités cellulolytiques déterminées sont:
- L'activité papier filtre (UPF : unité papier filtre) qui permet de doser l'activité
globale du pool enzymatique endoglucanases et exoglucanases - L'activité 8-glucosidase pour les activités spécifiques.
L'activité UPF est mesurée sur papier Whatman n 1 selon la procédure recommandée par la commission biotechnologique IUPAC, à la concentration initiale de 50 grl ; on détermine la prise d'essai de la solution enzymatique à
analyser qui libère l'équivalent de 2 g.1-1 de glucose (dosage colorimétrique) en 60 minutes. Le principe de l'activité papier filtre est de déterminer par dosage à l'acide dinitrosalicylique (DNS) la quantité de sucres réduits issue d'un papier Whatman N 1.
Le substrat utilisé pour déterminer l'activité 8-glucosidase est le p-nitropheny141-D-glucopyranoside (PNPG). Il est clivé par la fi-glucosidase qui libère le p-nitrophenol.
Une unité d'activité p-glucosidase est définie comme la quantité d'enzyme nécessaire pour produire 1pmol de nitrophenol à partir de PNPG par minute et est exprimée en IU/ml.
Les activités spécifiques sont obtenues en divisant les activités exprimées en IU/mL
par la concentration en cellulases. Elles sont exprimées en IU.mg-1.
La productivité finale est calculée en tenant compte de toute la masse des cellulases et hémicellulases produites durant la phase de production (incluant les prélèvements) et en la divisant par la durée de la phase de production et le volume utile du réacteur.
Le terme "Biomasse" caractérise la souche de Trichoderma reesei CL847.
Le terme "Protéine" est défini comme étant le cocktail enzymatique obtenu comprenant les cellulases et hémicellulases produites.
Les déterminations analytiques sur le moût final de l'exemple 1 donnent les résultats suivants :
Biomasse g/I : 14,4
12 Protéines g/I : 35,7 Productivité = 0,21 g/L/h UPF 22,1 IU/mL
P-Glucosidase spécifique : 0,8 Ill/mg Exemple 2: non conforme L'exemple 2 présente une culture analogue à l'exemple 1 sauf que le mode "fed-batch" est poursuivi au delà de 200h avec le même substrat d'alimentation. On constate qu'il y a un arrêt de la production de cellulases et hémicellulases après 200 h. Celles-ci commencent même à se dégrader puisque la concentration baisse de 37 g/L à 35 g/L. La biomasse augmente quant à elle durant cette période jusqu'à
atteindre une concentration de 20,9 g/L. Les dosages montrent qu'il y a eu une carence en soufre.
L'évolution de la concentration en biomasse et en protéines (g/L) est représentée sur la figure 1.
Les déterminations analytiques sur le moût final donnent les résultats suivants :
Biomasse g/L : 20,9 Protéines g/L: 35,1 Productivité = 0,13 g/L/h (Elle était de 0,17 g/L/h après 216 h) UPF 16,1 IU/mL
p-Glucosidase spécifique 0,7 Ili/mg Exemple 3: conforme à l'invention.
L'exemple 3 est lancé dans les mêmes conditions que l'exemple 1 mais comporte phases:
- Une phase a) en mode "batch" dans les mêmes conditions que l'exemple 1 mais avec une concentration en glucose de 60 g/L. Cette phase dure 50h, - Une deuxième phase a') en mode "fed-batch". Le fedbatch est lancé au moment de l'épuisement du substrat carboné glucose avec une solution d'hydrolysat hémicellulosique issue d'une paille prétraitée par explosion à la vapeur avec imprégnation préalable de H2SO4 dans laquelle a été dissout du glucose et du lactose pour arriver à une concentration globale en substrat carboné de 500g/L. Cette solution n'est pas stérilisée et son pH n'est pas remonté et est de 1. Un débit de 4 mL/h (soit un flux de 35 mg de sucres par g
P-Glucosidase spécifique : 0,8 Ill/mg Exemple 2: non conforme L'exemple 2 présente une culture analogue à l'exemple 1 sauf que le mode "fed-batch" est poursuivi au delà de 200h avec le même substrat d'alimentation. On constate qu'il y a un arrêt de la production de cellulases et hémicellulases après 200 h. Celles-ci commencent même à se dégrader puisque la concentration baisse de 37 g/L à 35 g/L. La biomasse augmente quant à elle durant cette période jusqu'à
atteindre une concentration de 20,9 g/L. Les dosages montrent qu'il y a eu une carence en soufre.
L'évolution de la concentration en biomasse et en protéines (g/L) est représentée sur la figure 1.
Les déterminations analytiques sur le moût final donnent les résultats suivants :
Biomasse g/L : 20,9 Protéines g/L: 35,1 Productivité = 0,13 g/L/h (Elle était de 0,17 g/L/h après 216 h) UPF 16,1 IU/mL
p-Glucosidase spécifique 0,7 Ili/mg Exemple 3: conforme à l'invention.
L'exemple 3 est lancé dans les mêmes conditions que l'exemple 1 mais comporte phases:
- Une phase a) en mode "batch" dans les mêmes conditions que l'exemple 1 mais avec une concentration en glucose de 60 g/L. Cette phase dure 50h, - Une deuxième phase a') en mode "fed-batch". Le fedbatch est lancé au moment de l'épuisement du substrat carboné glucose avec une solution d'hydrolysat hémicellulosique issue d'une paille prétraitée par explosion à la vapeur avec imprégnation préalable de H2SO4 dans laquelle a été dissout du glucose et du lactose pour arriver à une concentration globale en substrat carboné de 500g/L. Cette solution n'est pas stérilisée et son pH n'est pas remonté et est de 1. Un débit de 4 mL/h (soit un flux de 35 mg de sucres par g
13 de souche de Trichoderma reesei CL847 et par heure) est appliqué. Cette phase dure 100h.
- une phase b) de production continue de cellulases et hémicellulases est lancée par la suite. Le débit d'alimentation est maintenu constant à 4 mL/h durant toute l'expérience. Le réacteur est maintenu à un poids constant en soutirant continuellement le moût grâce à un système de régulation et à une pompe de soutirage commandable. Le taux de dilution est de 0,002 h-1.
Nous avons produit en continu à partir de 400h une solution enzymatique ayant une concentration supérieure à 100 g/L et avec une productivité supérieure à 0,2 g/L/h.
Ceci permet donc de tripler la concentration en protéines et d'avoir une productivité
supérieure à celle de l'exemple 1 (+20%) .
L'évolution de la concentration en biomasse et en protéines (g/L) au cours du temps pour l'exemple 3 dans lequel la phase continue est lancée après 150 h avec un débit de 4 mL/h est représentée sur la figure 2.
Les déterminations analytiques sur le moût final donnent les résultats suivants :
Biomasse g/L : 36,7 Protéines g/L : 107,2 Productivité finale = 0,26 g/L/h UPF 76,8 IU/mL
13-Glucosidase spécifique 1,2 111/mg Exemple 4: conforme L'exemple 4 est analogue à l'exemple 3 sauf que la phase b) continue de production est lancée directement après la phase a) de croissance en mode "batch" et que le débit d'alimentation en substrat carboné inducteur dans la phase b) continue de production est augmenté graduellement de 4mL/h à 8 mL/h, c'est-à-dire augmenté
de 1mL toutes les 12 h après le lancement ladite phase b). Le substrat carboné
inducteur utilisé est le même que celui de l'exemple 3, c'est-à-dire une solution d'hydrolysat hémicellulosique issue d'une paille prétraitée par explosion à la vapeur avec imprégnation préalable de H2SO4 dans laquelle a été dissout du glucose et du lactose. Cette solution n'est pas stérilisée et son pH n'est pas remonté et est de 1.
Les conditions opératoires utilisées dans les phases a) et b) sont identiques à celles utilisées dans l'exemple 3. A l'issue de l'augmentation du débit d'alimentation en
- une phase b) de production continue de cellulases et hémicellulases est lancée par la suite. Le débit d'alimentation est maintenu constant à 4 mL/h durant toute l'expérience. Le réacteur est maintenu à un poids constant en soutirant continuellement le moût grâce à un système de régulation et à une pompe de soutirage commandable. Le taux de dilution est de 0,002 h-1.
Nous avons produit en continu à partir de 400h une solution enzymatique ayant une concentration supérieure à 100 g/L et avec une productivité supérieure à 0,2 g/L/h.
Ceci permet donc de tripler la concentration en protéines et d'avoir une productivité
supérieure à celle de l'exemple 1 (+20%) .
L'évolution de la concentration en biomasse et en protéines (g/L) au cours du temps pour l'exemple 3 dans lequel la phase continue est lancée après 150 h avec un débit de 4 mL/h est représentée sur la figure 2.
Les déterminations analytiques sur le moût final donnent les résultats suivants :
Biomasse g/L : 36,7 Protéines g/L : 107,2 Productivité finale = 0,26 g/L/h UPF 76,8 IU/mL
13-Glucosidase spécifique 1,2 111/mg Exemple 4: conforme L'exemple 4 est analogue à l'exemple 3 sauf que la phase b) continue de production est lancée directement après la phase a) de croissance en mode "batch" et que le débit d'alimentation en substrat carboné inducteur dans la phase b) continue de production est augmenté graduellement de 4mL/h à 8 mL/h, c'est-à-dire augmenté
de 1mL toutes les 12 h après le lancement ladite phase b). Le substrat carboné
inducteur utilisé est le même que celui de l'exemple 3, c'est-à-dire une solution d'hydrolysat hémicellulosique issue d'une paille prétraitée par explosion à la vapeur avec imprégnation préalable de H2SO4 dans laquelle a été dissout du glucose et du lactose. Cette solution n'est pas stérilisée et son pH n'est pas remonté et est de 1.
Les conditions opératoires utilisées dans les phases a) et b) sont identiques à celles utilisées dans l'exemple 3. A l'issue de l'augmentation du débit d'alimentation en
14 substrat carboné inducteur, le taux de dilution est de 0,004 h-1. La masse du volume réactionnel est maintenue constante.
La productivité finale de l'expérience est de 0,39 g.L-1.h-1. Elle est presque doublée par rapport à l'exemple 1. Cela permet de réduire les coûts d'investissements.
La concentration finale en protéines est presque triplée. Ce qui permet de réduire les coûts de post-traitement notamment, le cas échéant, la concentration des protéines produites. La culture ne nécessite pas un kLa élevé (environ 75 h-1) grâce au faible taux de dilution appliqué permettant ainsi d'avoir des faibles coûts opératoires liés à
l'agitation et l'aération.
L'évolution de la productivité (rp) en cellulases et des concentrations en souches de T.reesei et en cellulases pour l'exemple 4 dans lequel la phase continue est lancée après 150h et le débit de fed-batch est augmenté de 4 à 8mL/h est représenté
sur la figure 3.
Les déterminations analytiques sur le moût final donnent les résultats suivants Biomasse g/L: 58,1 Protéines g/L :102,9 Productivité finale = 0,39 g/L/h UPF 77,6 IU/mL
f3-Glucosidase spécifique : 1,3 IU/mg La productivité est presque doublée par rapport à l'exemple 1 et la concentration en protéines presque triplée. Ladite concentration est maintenue pendant plus de 300h Exemple 5: non conforme L'exemple 5 permet de montrer l'effet de la non stérilisation de la solution d'hydrolysat hémicellulosique issue d'une paille prétraitée par explosion à la vapeur avec imprégnation préalable de H2SO4 sur les performances du procédé.
L'exemple 5 est lancé dans les mêmes conditions que l'exemple 4 sauf que la solution d'hydrolysat est stérilisée avant utilisation. La concentration de ladite solution est de 250 g/L. La culture aboutit à une forte accumulation de la souche de T
reesei et à une faible production de cellulases. La demande en oxygène est très importante en fin de culture avec un kLa nécessaire supérieur à 170h-1.
Le rendement de production de protéine par rapport au substrat carboné est inférieur à 0,1 g/g alors qu'il est de 0,3 g/g pour les exemples 1 à 4.
Les déterminations analytiques sur le moût final donnent les résultats suivants Biomasse : g/L: 99,8 Protéines : g/L: 24,2 5 UPF : 14,5 IU/mL
13-Glucosidase spécifique : 1,1 IU/mg Exemple 6: non-conforme L'Exemple 6 montre l'inconvénient de la mise en oeuvre de phase continue à
fort taux 10 de dilution qui conduisent à un milieu visqueux et à des problèmes de bouchage de la pompe de soutirage à cause de la morphologie du champignon lorsqu'il est en phase de croissance. Le kLa et donc le coût opératoire lié à l'agitation et l'aération du milieu est élevé.
L'exemple 6 est conduit dans les mêmes conditions que l'exemple 4 avec une
La productivité finale de l'expérience est de 0,39 g.L-1.h-1. Elle est presque doublée par rapport à l'exemple 1. Cela permet de réduire les coûts d'investissements.
La concentration finale en protéines est presque triplée. Ce qui permet de réduire les coûts de post-traitement notamment, le cas échéant, la concentration des protéines produites. La culture ne nécessite pas un kLa élevé (environ 75 h-1) grâce au faible taux de dilution appliqué permettant ainsi d'avoir des faibles coûts opératoires liés à
l'agitation et l'aération.
L'évolution de la productivité (rp) en cellulases et des concentrations en souches de T.reesei et en cellulases pour l'exemple 4 dans lequel la phase continue est lancée après 150h et le débit de fed-batch est augmenté de 4 à 8mL/h est représenté
sur la figure 3.
Les déterminations analytiques sur le moût final donnent les résultats suivants Biomasse g/L: 58,1 Protéines g/L :102,9 Productivité finale = 0,39 g/L/h UPF 77,6 IU/mL
f3-Glucosidase spécifique : 1,3 IU/mg La productivité est presque doublée par rapport à l'exemple 1 et la concentration en protéines presque triplée. Ladite concentration est maintenue pendant plus de 300h Exemple 5: non conforme L'exemple 5 permet de montrer l'effet de la non stérilisation de la solution d'hydrolysat hémicellulosique issue d'une paille prétraitée par explosion à la vapeur avec imprégnation préalable de H2SO4 sur les performances du procédé.
L'exemple 5 est lancé dans les mêmes conditions que l'exemple 4 sauf que la solution d'hydrolysat est stérilisée avant utilisation. La concentration de ladite solution est de 250 g/L. La culture aboutit à une forte accumulation de la souche de T
reesei et à une faible production de cellulases. La demande en oxygène est très importante en fin de culture avec un kLa nécessaire supérieur à 170h-1.
Le rendement de production de protéine par rapport au substrat carboné est inférieur à 0,1 g/g alors qu'il est de 0,3 g/g pour les exemples 1 à 4.
Les déterminations analytiques sur le moût final donnent les résultats suivants Biomasse : g/L: 99,8 Protéines : g/L: 24,2 5 UPF : 14,5 IU/mL
13-Glucosidase spécifique : 1,1 IU/mg Exemple 6: non-conforme L'Exemple 6 montre l'inconvénient de la mise en oeuvre de phase continue à
fort taux 10 de dilution qui conduisent à un milieu visqueux et à des problèmes de bouchage de la pompe de soutirage à cause de la morphologie du champignon lorsqu'il est en phase de croissance. Le kLa et donc le coût opératoire lié à l'agitation et l'aération du milieu est élevé.
L'exemple 6 est conduit dans les mêmes conditions que l'exemple 4 avec une
15 première phase a) de croissance en mode "batch" qui dure 50 h et une phase b) continue de production de cellulases et hémicellulases. La solution qui aliment la phase de production est une solution d'hydrolysat hémicellulosique qui n'est pas stérilisée dans laquelle on dissout du lactose à 250 g/L. Le débit d'alimentation en -substrat carboné inducteur est de 13 ml/h ce qui correspond à 54 mg de sucres par g de souche de Trichoderma reesei CL847 et par heure. La masse du volume réactionnel est maintenue constante et le taux de dilution appliqué est de 0,025 h-1.
La conduite de l'expérience a été très difficile avec un bouchage répétitif de la pompe de soutirage, le milieu étant très visqueux lorsque le champignon est en croissance.
Il y a eu une forte production de champignon et la consigne de p02 n'a pas pu être maintenue au dessus de 0%. L'état stationnaire n'a pas pu être atteint. Le kLa du bioréacteur n'était pas suffisant pour amener l'oxygène nécessaire permettant de consommer tout le flux de sucre de l'alimentation. Des kLa de 700 h-1 ont pourtant été
mesurés sur eau avec ce réacteur.
Exemple 7: non-conforme L'exemple 7 est conduit dans les mêmes conditions que l'exemple 3 à la différence près que la phase en mode "batch" est réalisée avec une concentration en glucose de 65 g/L. La phase a') en mode "fed-batch" et la phase b) de production en mode continu sont réalisées dans les mêmes conditions à la différence près que la solution qui alimente les phases a') et b) est une solution de lactose à 250 g/L
acidifiée par ajout d'acide sulfurique H2S0.4 de sorte que ladite solution ait un pH de 1,5.
Les
La conduite de l'expérience a été très difficile avec un bouchage répétitif de la pompe de soutirage, le milieu étant très visqueux lorsque le champignon est en croissance.
Il y a eu une forte production de champignon et la consigne de p02 n'a pas pu être maintenue au dessus de 0%. L'état stationnaire n'a pas pu être atteint. Le kLa du bioréacteur n'était pas suffisant pour amener l'oxygène nécessaire permettant de consommer tout le flux de sucre de l'alimentation. Des kLa de 700 h-1 ont pourtant été
mesurés sur eau avec ce réacteur.
Exemple 7: non-conforme L'exemple 7 est conduit dans les mêmes conditions que l'exemple 3 à la différence près que la phase en mode "batch" est réalisée avec une concentration en glucose de 65 g/L. La phase a') en mode "fed-batch" et la phase b) de production en mode continu sont réalisées dans les mêmes conditions à la différence près que la solution qui alimente les phases a') et b) est une solution de lactose à 250 g/L
acidifiée par ajout d'acide sulfurique H2S0.4 de sorte que ladite solution ait un pH de 1,5.
Les
16 évolutions des concentrations en biomasse cellulaire et en protéines sont présentées sur la figure 4. Sont également représentées sur la figure 4 l'évolution des concentrations en sulfates et en ions ammonium qui sont non limitant.
L'expérience ne permet pas d'obtenir une concentration en protéines supérieure à 50 g/L. La concentration en protéines se stabilise à 50 g/L après 400 heures.
Les résultats obtenus montrent l'importance de l'utilisation d'une solution d'hydrolysats hémicellulosiques dans la phase continu de production et que les performances obtenues ne sont pas dues à la levée de la carence en soufre et azote.
Les déterminations analytiques sur le moût final donnent les résultats suivants :
Biomasse : g/L : 23 Protéines : g/L :48,3 UPF : 31,2 (3-Glucosidase spécifique : 1,1 Exemple 8: non-conforme L'exemple 8 est conduit dans les mêmes conditions que l'exemple 3 à la différence près que la solution d'hydrolysat hémicellulosique issue d'une paille prétraitée par explosion à la vapeur avec imprégnation préalable de H2SO4 dans laquelle a été
dissout du glucose et du lactose n'est pas stérilisée mais subit une rectification de son pH par ajout de NaOH. Son pH est remonté à 4.
La production de protéines s'arrête après 160 h et reste stable à une concentration proche de 20 g/L.
Les déterminations analytiques sur le moût final donnent les résultats suivants :
Biomasse : g/L: 25,1 Protéines : g/L: 19,8 UPF : 15,8 IU/mL
(3-Glucosidase spécifique : 1,2 IU/mg
L'expérience ne permet pas d'obtenir une concentration en protéines supérieure à 50 g/L. La concentration en protéines se stabilise à 50 g/L après 400 heures.
Les résultats obtenus montrent l'importance de l'utilisation d'une solution d'hydrolysats hémicellulosiques dans la phase continu de production et que les performances obtenues ne sont pas dues à la levée de la carence en soufre et azote.
Les déterminations analytiques sur le moût final donnent les résultats suivants :
Biomasse : g/L : 23 Protéines : g/L :48,3 UPF : 31,2 (3-Glucosidase spécifique : 1,1 Exemple 8: non-conforme L'exemple 8 est conduit dans les mêmes conditions que l'exemple 3 à la différence près que la solution d'hydrolysat hémicellulosique issue d'une paille prétraitée par explosion à la vapeur avec imprégnation préalable de H2SO4 dans laquelle a été
dissout du glucose et du lactose n'est pas stérilisée mais subit une rectification de son pH par ajout de NaOH. Son pH est remonté à 4.
La production de protéines s'arrête après 160 h et reste stable à une concentration proche de 20 g/L.
Les déterminations analytiques sur le moût final donnent les résultats suivants :
Biomasse : g/L: 25,1 Protéines : g/L: 19,8 UPF : 15,8 IU/mL
(3-Glucosidase spécifique : 1,2 IU/mg
Claims (12)
1. Procédé de production de cellulases et hémicellulases par une souche appartenant à un champignon filamenteux, en bioréacteur agité et aéré
comprenant au moins deux phases :
- une phase a) de croissance de ladite souche en présence d'au moins un substrat carboné de croissance en réacteur fermé, ladite phase de croissance étant réalisée avec une concentration en substrat carboné de croissance comprise entre 10 et g/L
- une phase b) continue de production de cellulases dans laquelle au moins un substrat carboné inducteur est alimenté à un débit d'alimentation au moins constant pendant une durée au moins supérieure à 200h, ledit substrat carboné inducteur étant au moins une solution aqueuse d'hydrolysat hérnicellulosique issu d'un prétraitement acide d'un substrat lignocellulosique, ladite solution aqueuse d'hydrolysat hémicellulosique ne subissant pas de stérilisation préalable et pas de rectification de pH, ledit pH de la solution aqueuse étant compris entre 0,5 et 3, la masse du volume réactionnel étant maintenu constant par soutirage d'une fraction dudit volume réactionnel, ladite phase b) opérant à un taux de dilution compris entre 0,002 et 0,008h-1.
comprenant au moins deux phases :
- une phase a) de croissance de ladite souche en présence d'au moins un substrat carboné de croissance en réacteur fermé, ladite phase de croissance étant réalisée avec une concentration en substrat carboné de croissance comprise entre 10 et g/L
- une phase b) continue de production de cellulases dans laquelle au moins un substrat carboné inducteur est alimenté à un débit d'alimentation au moins constant pendant une durée au moins supérieure à 200h, ledit substrat carboné inducteur étant au moins une solution aqueuse d'hydrolysat hérnicellulosique issu d'un prétraitement acide d'un substrat lignocellulosique, ladite solution aqueuse d'hydrolysat hémicellulosique ne subissant pas de stérilisation préalable et pas de rectification de pH, ledit pH de la solution aqueuse étant compris entre 0,5 et 3, la masse du volume réactionnel étant maintenu constant par soutirage d'une fraction dudit volume réactionnel, ladite phase b) opérant à un taux de dilution compris entre 0,002 et 0,008h-1.
2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel ladite souche est une souche de Trichoderma reesei modifiée par mutation, sélection ou recombinaison génétique.
3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2 dans lequel le substrat carboné de croissance utilisé dans ladite phase de croissance est choisi le glucose, le lactose, le xylose, les résidus obtenus après fermentation éthanolique des sucres monomères des hydrolysats enzymatiques de substrat lignocellulosique et les extraits de la fraction hémicellulosique sous forme de monomères provenant de substrat lignocellulosique prétraité, utilisé seul ou en mélange.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 dans lequel le prétraitement acide est une hydrolyse acide, une cuisson acide ou une explosion à la vapeur avec imprégnation préalable dudit substrat lignocellulosique avec une solution aqueuse d'acide sulfurique.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4 dans lequel le substrat carboné
inducteur utilisé dans la phase b) est une solution aqueuse d'hydrolysat hémicellulosique issu d'un prétraitement acide d'un substrat lignocellulosique en mélange avec au moins un autre substrat carboné choisi parmi des sucres inducteurs ou non inducteurs.
inducteur utilisé dans la phase b) est une solution aqueuse d'hydrolysat hémicellulosique issu d'un prétraitement acide d'un substrat lignocellulosique en mélange avec au moins un autre substrat carboné choisi parmi des sucres inducteurs ou non inducteurs.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5 dans lequel la durée de la phase b) continue de production de cellulases est au moins supérieure à 300h.
7. Procédé selon la revendication 6 dans lequel la durée de la phase b) continue de production de cellulases est au moins supérieure à 400h.
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7 dans lequel le débit d'alimentation dudit substrat carboné inducteur est compris entre 35 et 140 mg de substrat carboné
inducteur par gramme en poids sec de souche et par heure.
inducteur par gramme en poids sec de souche et par heure.
9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8 dans lequel le débit d'alimentation est graduellement augmenté dans la phase b).
10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9 dans lequel une phase optionnelle a') de croissance et de production réalisée dans un réacteur à alimentation continue d'au moins un substrat carboné inducteur, au cours de laquelle aucun soutirage du contenu du fermenteur n'est effectué, est mise en oeuvre entre la phase a) et la phase b).
11. Procédé selon la revendication 10 dans lequel ledit substrat carboné
inducteur utilisé dans la phase a') est identique au substrat carboné inducteur utilisé
dans la phase b) de production.
inducteur utilisé dans la phase a') est identique au substrat carboné inducteur utilisé
dans la phase b) de production.
12. Procédé selon l'une des revendications 10 ou 11 dans lequel la phase a') est mise en uvre pendant une durée comprise entre 50 et 150 h.
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